Indflydelse af Finishing Clear Aligner Marginal Terminationsdesign på Subgingival Periodontal Mikrobiota Under Ortodontisk Behandling: En Split-Mouth-undersøgelse. (PATHO-ALIGN)

- BAGGGRUND OG RATIONALE

Klare aligner-terapi er udbredt i ortodonti. To trimlinje-design anvendes almindeligvis under afslutningsfasen. Det supragingivale design bruger et lige vandret snit placeret cirka 2 mm apikalt til den frie gingivale margin: aligner-kanten dækker cirka 2 mm af gingiv væv med direkte kontakt, men trænger ikke ind i den gingivale sulcus. Det juxtagingivale festonerede design bruger et bølget snit, der følger den frie gingivale margins naturlige kontur nøjagtigt, og slutter ved gingivmarginen uden at dække gingiv væv og uden at trænge ind i sulcus. De to designs afviger fundamentalt i deres forhold til gingivmarginen. Det supragingivale design skaber et semi-lukket mikromiljø ved sulcus-indgangen: ved at dække 2 mm af gingiv væv begrænser aligneren tilgangen af spyt og atmosfærisk oxygen til sulcus-indgangsregionen. Reduceret spytklaring og nedsat oxygentension er etablerede forhold, der favoriserer anaerob bakterievækst i det parodontale miljø. Om 2 mm af gingiv vævdækning af aligner-kanten er tilstrækkelig til at producere en målebar ændring i sulculær oxygentension eller spytklaring er ikke direkte påvist og udgør den biologiske hypotese under undersøgelse. Det juxtagingivale design, der følger gingivkonturen ved dens margin, efterlader sulcus-indgangen mere tilgængelig for spyt og oxygen, og opretholder potentielt mindre favorable forhold for anaerob kolonisering. Disse mikromiljøforskelle er ikke undersøgt i offentliggjorte studier. Ingen tidligere undersøgelse har undersøgt, om trimlinje-geometri påvirker subgingival parodontal mikrobiota-sammensætning hos patienter, der gennemgår aligner-terapi.

• STUDIEDESIGN

Dette er et prospektivt, longitudinelt, intra-individuelt (split-mouth) interventionsstudie. Hver deltager modtager begge trimlinje-design samtidigt: supragingivalt på en dental bue og juxtagingivalt festoneret på den kontralaterale bue. Split-mouth-designet kontrollerer for inter-individuel variation i systemisk sundhed, mundhygiejne, spyt-sammensætning og baseline mikrobiologisk status. Aligner-materialet (CA Pro tri-lag, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Tyskland; CE-mærket termoplast) er identisk for begge designs; kun trimlinje-geometri afviger.

• ALLOCERINGSREGEL (IKKE-RANDOMISERET)

Allokering følger en forudbestemt hierarkisk regel dokumenteret før indskrivning:

1. Primært kriterium: Den dentale bue med den største størrelse af planlagt dental intrusion (mm, fra det digitale behandlingssetup før fabrikation) modtager det supragingivale design, i overensstemmelse med dens kliniske indikation for vertikal kraftoverførsel.

2. Uafgjort (ligelig eller nul planlagt intrusion på begge buer): En forudbestemt systematisk alternerende sekvens i indskrivningsrækkefølge. Den første deltager, der opfylder dette kriterium, modtager supragingivalt på maxillarbuen; den anden på mandibulærbuen; og så videre. Dette sikrer en cirka 50/50 balance i bue-niveau fordeling og forhindrer bue-niveau forvirring. Planlagt intrusionsstørrelse per bue registreres som en kontinuert kovariat i alle statistiske modeller.

   - BASELINEVURDERING (T0)

   Et enkelt samlet baseline-prøve indsamles ved at udtage tre indekssteder per bue (seks papirpoint i alt: tre per bue), kombineret i et Eppendorf-rør ved T0. Dette begrundes med split-mouth-designets fundamentale antagelse: hos deltagere med klinisk sund parodontal status ved baseline (inklusionskriterie: sondedybde 3 mm eller mindre, ingen BOP ved indekssteder), forventes ingen klinisk meningsfuld bue-specifik mikrobiologisk forskel før nogen intervention. Den subgingivale mikrobiom hos parodontalt sunde individer afspejler den fælles spytreservoir delt af begge buer. T0-prøven karakteriserer overordnet baseline patogenstatus. Den primære mellem-arm sammenligning udføres kun ved T1 og T2, hvor bue-specifikke prøver er tilgængelige.

   - PRØVETOTALER: 175 PCR-rør (35 evaluerbare deltagere x 5 rør per deltager: 1 samlet ved T0 + 2 bue-specifikke ved T1 + 2 bue-specifikke ved T2). Samlede papirpoint: 525 (35 x 15: 6 ved T0 [3 per bue x 2 buer samlet] + 3 ved T1 per bue x 2 buer + 3 ved T2 per bue x 2 buer). Enheden for PCR-analyse forbliver et resultat per bue per tidspunkt; sammenblanding af tre papirpoint per bue øger det biologiske materiale per rør og forbedrer PCR-følsomhed uden at ændre den analytiske enhed eller styrkeberegningen.

   - PRØVEINDSAMLINGSPROCEDURE

   Alle indsamlinger udføres under standardiserede fastebetingelser (à jeun): deltagere afholder sig fra at spise, drikke (vand tilladt), børste tænder, bruge mundskylning og fra at fjerne aligneren i mindst 8 timer før indsamling (overnatningsaligner-brug). Indsamlinger finder sted om morgenen. Ved hvert besøg fjernes supragingival plak forsigtigt fra hver indekstand med en steril kurette uden at trænge ind i sulcus, og området isoleres med bomuldsruller. Tre sterile papirpoint (størrelse #25, som specificeret af Sacace PeriodontScreen Real-TM kit) indføres sekventielt i de tre indekssteder per bue, hver holdt på plads i 10-20 sekunder. De tre papirpoint fra samme bue samles umiddelbart i et enkelt Eppendorf-rør (200 ul steril PBS), hvilket giver en biologisk prøve per bue per tidspunkt.

   - INDEKSPLADSVALG (forudbestemt, registreret ved T0, uændret ved T1 og T2): Primær regel: De tre steder med den største sondedybde inden for hver bue vælges som indekssteder, uanset deres anatomiske zone (for-, premolar eller molar). Alle tre steder kan være i samme zone, hvis disse er de dybeste. Uafgjort - Maxillarbue (når to eller flere steder deler den største sondedybde og færre end tre unikke dybeste steder kan skelnes): mesial på tand 1.6 + mesial på tand 2.6 + central på tand 1.1. Dette valg er i overensstemmelse med de maxillære udtagelsessteder brugt af Lombardo et al. (2021), som indsamlede subgingivale prøver fra højre øvre første molar og højre øvre centrale incisiv. Uafgjort - Mandibulær bue: mesial på tand 4.6 + mesial på tand 3.6 + central på tand 4.1. Denne regel er defineret a priori af undersøgeren som den anatomiske spejling af den maxillære uafgjort (molar-molar-incisiv), anvendt på den mandibulære bue ved at bruge de samme tandtyper i de tilsvarende positioner. Ingen offentliggjort undersøgelse om subgingival mikrobiota hos ortodontiske patienter blev identificeret, der brugte en identisk mandibulær uafgjort regel; reglen er derfor forudbestemt og dokumenteret her som en undersøger-defineret protokolbeslutning. De samme tre indekssteder per bue bruges ved T1 og T2.

   - OVERHOLDSELSMONITORING OG FRAUDSPROTOKOL

   Aligner-brugsoverholdelse (mål 22 timer/dag eller mere) vurderes ved selvrapportering ved hvert studiebesøg. Deltagere, der rapporterer overholdelse under 22 timer/dag ved to eller flere på hinanden følgende besøg, trækkes fra studiet, og deres data udelukkes fra per-protokol analyse. Et enkelt besøg med rapporteret ikke-overholdelse udløser verbal forstærkning og registreres som en protokolafvigelse. Alle indskrevne deltagere inkluderes i en intent-to-treat beskrivelse uanset overholdelsesstatus. Ved T0: seks papirpoint (tre per bue) samles alle i et Eppendorf-rør (200 ul steril PBS) - et rør i alt per deltager ved baseline. Ved T1 og T2: tre papirpoint per bue samles i separate Eppendorf-rør per bue (supragingival-design bue og juxtagingival-design bue), mærket med deltagerkode, tidspunkt og buebetegnelse - to rør per deltager per tidspunkt. Rør fryses ved -20 grader C inden for 2-4 timer på Aorys Clinic, Sibiu. Prøver transporteres i partier til Department of Microbiology, UMFST Targu Mures, i isolerede beholdere med frosne gelpakker (transport cirka 2-2,5 timer). Opbevaring ved -20 grader C før analyse er i overensstemmelse med validerede protokoller for subgingival bakteriel DNA-bevaring.

   - LABORATORIEANALYSE

   Prøver analyseres på Department of Microbiology, George Emil Palade University of Medicine, Pharmacy, Science, and Technology of Targu Mures og Mures County Clinical Hospital, ved brug af PeriodontScreen Real-TM kit (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italien; REF T01707-96-S; CE-mærket IVD). DNA-ekstraktion: Papirpoint vortexes i PBS (30 sekunder) for at eluere bakterier. Suspension centrifugeres (12.000 x g, 2-3 minutter), supernatant fjernes, og bakterielt DNA ekstraheres fra pellet ved brug af et kommercielt ekstraktionskit (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, eller tilsvarende valideret kit) ifølge fabrikantens instruktioner. Real-time PCR: PeriodontScreen Real-TM assay detekterer og kvantificerer syv parodontale patogenarter ved brug af specifikke fluorescerende probes (FAM-kanal, 40 cyklusser; HEX-kanal intern kontrol). Kit-validerede kliniske signifikansgrænser: A. actinomycetemcomitans 10^4 kopier/reaktion eller mere; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 eller mere; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 eller mere. Et resultat er positivt for en given patogen, når FAM Ct er mindre end 35. Et resultat betragtes som gyldigt, når FAM Ct er mindre end 35 (uanset HEX Ct-værdi), eller når HEX Ct er mindre end 35. Et resultat betragtes som ugyldigt og skal gentages, når både FAM Ct og HEX Ct er større end 35 eller fraværende, hvilket indikerer mulig ekstraktionsfejl eller PCR-hæmning. Laboratoriepersonale modtager kodede rør (deltagerkode, bue, tidspunkt) uden viden om, hvilken bue der svarer til hvilket trimlinje-design. Derudover er prøveindsamleren (en almen tandlægespecialist og ortodontisk resident, adskilt fra den behandlende kliniker) fuldstændig blind for bueallokering på alle tidspunkter: indsamleren udfører al subgingival udtagelse uden viden om, hvilket trimlinje-design der er tildelt hver bue. Den behandlende kliniker (PI) opbevarer allokeringsnøglen, frigivet først efter alle PCR-analyser er fuldført.

   - STATISTISK ANALYSE

   Bekræftende primær analyse: Det bekræftende endepunkt er bue-niveau patogenbyrdescore (0-7) ved T2 (8 uger). En enkelt Wilcoxon signed-rank test (parret, tosidet, alfa = 0,05) sammenligner supragingivale versus juxtagingivale bue-scores ved T2. Denne test blev valgt, fordi udfaldet er en diskret ordinal optælling (heltal 0-7) i et parret split-mouth design, for hvilken ikke-parametrisk parret sammenligning er passende og ikke kræver distributionsantagelser. En enkelt bekræftende test ved T2 er forudbestemt for at kontrollere type I-fejlraten ved alfa = 0,05 uden korrektion for multiplisitet.

   - Støttende analyse ved T1: Wilcoxon signed-rank testen vil også blive anvendt ved T1 (4 uger) som en støttende, ikke-bekræftende analyse for at karakterisere det temporale mønster af enhver observeret effekt. Resultater ved T1 rapporteres beskrivende; ingen bekræftende slutning vil blive trukket fra T1-testen.

   Justeret analyse: En Generalized Estimating Equations (GEE) model vil blive tilpasset til bue-niveau patogenbyrdescores ved T1 og T2, med følgende specifikation: (1) respons: bue-niveau patogenbyrdescore (0-7); (2) link-funktion: identitet; (3) distributionsfamilie: Gaussisk; (4) arbejdende korrelationsstruktur: udskiftelig, passende for to post-baseline tidspunkter med ligelig intra-subjekt korrelation antaget på tværs af tid; (5) kovariater: trimlinje-design (binær: supragingival vs. juxtagingival), tidspunkt (kategorisk: T1, T2), planlagt intrusionsstørrelse per bue (kontinuert, mm). Design x tidspunkt interaktionstermen testes for at vurdere, om effekten af trimlinje-design afviger mellem T1 og T2; hvis interaktionstermen ikke er statistisk signifikant (p > 0,10), vil den blive droppet, og en kun-hovedeffekter model rapporteres. GEE-modellen tager højde for intra-subjekt korrelation på tværs af tidspunkter og justerer for den forudbestemte ikke-randomiserede allokeringsvariabel (planlagt intrusionsstørrelse). GEE-analyser udføres ved brug af geepack-pakken i R (version 4.0 eller senere).

   • Udforskende analyse: McNemar's test sammenligner bue-niveau rød kompleks positivitet (binært udfald) mellem de to designs ved T1 og T2. Fortolkes kun beskrivende; ingen bekræftende slutning vil blive trukket. Forventet styrke for dette udforskende udfald er cirka 22%, på grund af den lave forventede prævalens af simultan rød kompleks positivitet hos parodontalt sunde deltagere. Denne lave styrke anerkendes, og udfaldet registreres som udforskende i overensstemmelse hermed.
   • Manglende data: Manglende udfaldsdata håndteres ved komplet-case analyse. Deltagere med evaluerbare data ved både T1 og T2 udgør per-protokol populationen brugt i den bekræftende analyse. Alle indskrevne deltagere, inklusive dem der trækker sig efter T0, beskrives i intent-to-treat populationen; ingen imputation udføres for den primære analyse, givet den forventede frafaldsrate på 10% eller mindre.
   • Software: Primær bekræftende analyse (Wilcoxon signed-rank test) og beskrivende statistik udføres ved brug af GraphPad Prism 8 (version 8.0.2). GEE-modeller udføres i R (version 4.0 eller senere). Alle rapporterede p-værdier er tosidede. Ingen mellemliggende analyser er planlagt.
   • STIKPRØVESTØRRELSEBEGRUNDELSE

   Stikprøvestørrelse blev bestemt ved Monte Carlo-simulation (10.000 iterationer) for et parret intra-subjekt (split-mouth) design. Simulationsparametre blev valgt konservativt i fravær af offentliggjorte pilotdata specifikt om trimlinje-design effekter på subgingival patogenbyrde:

(1) minimal klinisk meningsfuld forskel mellem buer: 0,5 art over grænse, repræsenterende en ekstra patogenart, der krydser den kliniske signifikansgrænse i den supragingivale sammenlignet med den juxtagingivale bue; (2) standardafvigelse af individuelle bue-niveau scores (sigma): 0,88, hvilket indebærer en standardafvigelse af parrede forskelle (sigma_D) på 0,964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0,88 x sqrt(1,2) = 0,964]; dette repræsenterer et konservativt estimat af inter-deltager variabilitet i fravær af pilotdata; parrede forskelle blev simuleret som cirka symmetriske (Gaussisk copula med normale marginaler), hvilket er en konservativ baseline for Wilcoxon styrkeestimation; (3) intra-subjekt korrelation rho = 0,4, i overensstemmelse med værdier rapporteret for split-mouth parodontale mikrobiologiske studier; (4) tosidet alfa = 0,05; (5) Wilcoxon signed-rank test.

Simulation gav estimeret styrke = 82,7% (primær) og 82,3% (uafhængig verifikation), med empirisk type I-fejl = 5,0%, ved n = 35 evaluerbare deltagere. For at tage højde for en forventet frafaldsrate på cirka 10% (tab til opfølgning, ikke-overholdelse med 22 t/d aligner-brug, protokolafvigelser), blev et indskrivningsmål på 39 deltagere sat.

- BEGRÆNSNINGER

PeriodontScreen Real-TM kit blev valideret for populationer med aktiv parodontal sygdom; dens kliniske signifikansgrænser er muligvis ikke fuldt ud kalibreret for den sunde parodontale status af indskrevne deltagere. Resultater vil blive fortolket i overensstemmelse hermed.

Den ikke-randomiserede allokeringsregel introducerer potentiale for bue-niveau biomekanisk forvirring ud over planlagt intrusionsstørrelse (f.eks. drejningskorrektioner, transversale bevægelser), som ikke fuldt ud fanges af GEE-kovariaten. Planlagt intrusionsstørrelse per bue registreres og justeres for som en kontinuert kovariat i GEE-modellen; residual biomekanisk forvirring fra andre bevægelsestyper kan ikke udelukkes.

Fordi T0-prøven repræsenterer en samlet bilateral prøve, er bue-specifikke baseline patogenscores ikke tilgængelige. Den primære analyse sammenligner derfor bue-specifikke scores ved T1 og T2 direkte, uden justering for individuelle bue-niveau baselineværdier. Denne begrænsning mildnes ved inklusionskriteriet om klinisk sund parodontal status ved baseline (sondedybde 3 mm eller mindre, ingen blødning ved sondering ved indekssteder), hvilket minimerer sandsynligheden for forudgående bue-niveau mikrobiologisk asymmetri før intervention.