Influencia del Diseño de Terminación Marginal del Alineador Transparente de Acabado sobre la Microbiota Periodontal Subgingival Durante el Tratamiento de Ortodoncia: Un Estudio de Boca Dividida. (PATHO-ALIGN)

- ANTECEDENTES Y FUNDAMENTOS

La terapia con alineadores transparentes se utiliza ampliamente en ortodoncia. Dos diseños de línea de recorte se emplean comúnmente durante la fase de acabado. El diseño supragingival utiliza un corte horizontal recto posicionado aproximadamente a 2 mm apical del margen gingival libre: el borde del alineador cubre aproximadamente 2 mm de tejido gingival con contacto directo pero no penetra en el surco gingival. El diseño festoneado yuxtagingival utiliza un corte festoneado que sigue exactamente el contorno natural del margen gingival libre, terminando en el margen gingival sin cubrir tejido gingival y sin entrar en el surco. Los dos diseños difieren fundamentalmente en su relación con el margen gingival. El diseño supragingival crea un microambiente semicerrado en la entrada del surco: al cubrir 2 mm de tejido gingival, el alineador limita el acceso de saliva y oxígeno atmosférico a la región de la entrada del surco. La reducción del aclaramiento salival y la disminución de la tensión de oxígeno son condiciones establecidas que favorecen el crecimiento bacteriano anaeróbico en el entorno periodontal. Si la cobertura de 2 mm de tejido gingival por el borde del alineador es suficiente para producir un cambio medible en la tensión de oxígeno del surco o en el aclaramiento salival no se ha demostrado directamente y constituye la hipótesis biológica bajo investigación. El diseño yuxtagingival, al seguir el contorno gingival en su margen, deja la entrada del surco más accesible a la saliva y al oxígeno, manteniendo potencialmente condiciones menos favorables para la colonización anaeróbica. Estas diferencias microambientales no han sido investigadas en estudios publicados. Ningún estudio previo ha examinado si la geometría de la línea de recorte afecta la composición de la microbiota periodontal subgingival en pacientes sometidos a terapia con alineadores.

• DISEÑO DEL ESTUDIO

Este es un estudio intervencional prospectivo, longitudinal, intraindividual (boca dividida). Cada participante recibe ambos diseños de línea de recorte simultáneamente: supragingival en una arcada dental y yuxtagingival festoneado en la arcada contralateral. El diseño de boca dividida controla la variación interindividual en salud sistémica, higiene oral, composición salival y estado microbiológico basal. El material del alineador (CA Pro tri-capa, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Alemania; termoplástico marcado CE) es idéntico para ambos diseños; solo difiere la geometría de la línea de recorte.

• REGLA DE ASIGNACIÓN (NO ALEATORIZADA)

La asignación sigue una regla jerárquica preespecificada documentada antes de la inscripción:

1. Criterio primario: La arcada dental con mayor magnitud de intrusión dental planificada (mm, desde la planificación digital del tratamiento antes de la fabricación) recibe el diseño supragingival, consistente con su indicación clínica para la transmisión de fuerzas verticales.

2. Desempate (intrusión planificada igual o cero en ambas arcadas): Una secuencia alternante sistemática preespecificada en el orden de inscripción. El primer participante que cumple este criterio recibe supragingival en la arcada maxilar; el segundo en la arcada mandibular; y así sucesivamente. Esto asegura un equilibrio aproximado de 50/50 en la distribución a nivel de arcada y evita la confusión a nivel de arcada. La magnitud de intrusión planificada por arcada se registra como covariable continua en todos los modelos estadísticos.

   - EVALUACIÓN BASAL (T0)

   Se recoge un único espécimen basal combinado muestreando tres sitios índice por arcada (seis conos de papel en total: tres por arcada), combinados en un tubo Eppendorf en T0. Esto se justifica por la suposición fundamental del diseño de boca dividida: en participantes con estado periodontal clínicamente sano al inicio (criterio de inclusión: profundidad de sondaje de 3 mm o menos, sin sangrado al sondaje en los sitios índice), no se espera una diferencia microbiológica específica por arcada clínicamente significativa antes de cualquier intervención. El microbioma subgingival de individuos periodontalmente sanos refleja el reservorio salival común compartido por ambas arcadas. El espécimen T0 caracteriza el estado patógeno basal general. La comparación primaria entre brazos se realiza solo en T1 y T2, donde están disponibles los especímenes específicos por arcada.

   - TOTALES DE ESPÉCIMENES: 175 tubos de PCR (35 participantes evaluables x 5 tubos por participante: 1 combinado en T0 + 2 específicos por arcada en T1 + 2 específicos por arcada en T2). Total de conos de papel: 525 (35 x 15: 6 en T0 [3 por arcada x 2 arcadas combinadas] + 3 en T1 por arcada x 2 arcadas + 3 en T2 por arcada x 2 arcadas). La unidad de análisis de PCR sigue siendo un resultado por arcada por punto temporal; la combinación de tres conos de papel por arcada aumenta el material biológico por tubo y mejora la sensibilidad de la PCR sin cambiar la unidad analítica ni el cálculo de potencia.

   - PROCEDIMIENTO DE RECOGIDA DE MUESTRAS

   Todas las recogidas se realizan en condiciones estandarizadas de ayuno (a jeun): los participantes se abstienen de comer, beber (se permite agua), cepillarse, usar enjuague bucal y de quitarse el alineador al menos 8 horas antes de la recogida (uso nocturno del alineador). Las recogidas tienen lugar por la mañana. En cada visita, la placa supragingival se elimina suavemente de cada diente índice con una cureta estéril sin entrar en el surco, y el área se aísla con rollos de algodón. Se insertan secuencialmente tres conos de papel estériles (tamaño #25, según especifica el kit Sacace PeriodontScreen Real-TM) en los tres sitios índice por arcada, cada uno mantenido en su lugar durante 10-20 segundos. Los tres conos de papel de la misma arcada se combinan inmediatamente en un único tubo Eppendorf (200 ul de PBS estéril), produciendo un espécimen biológico por arcada por punto temporal.

   - SELECCIÓN DE SITIOS ÍNDICE (preespecificada, registrada en T0, sin cambios en T1 y T2): Regla primaria: Se seleccionan como sitios índice los tres sitios con mayor profundidad de sondaje dentro de cada arcada, independientemente de su zona anatómica (anterior, premolar o molar). Los tres sitios pueden estar en la misma zona si son los más profundos. Desempate - Arcada maxilar (cuando dos o más sitios comparten la mayor profundidad de sondaje y no se pueden distinguir menos de tres sitios únicos más profundos): mesial del diente 1.6 + mesial del diente 2.6 + central del diente 1.1. Esta selección es consistente con los sitios de muestreo maxilares utilizados por Lombardo et al. (2021), quienes recogieron especímenes subgingivales del primer molar superior derecho y del incisivo central superior derecho. Desempate - Arcada mandibular: mesial del diente 4.6 + mesial del diente 3.6 + central del diente 4.1. Esta regla se define a priori por el investigador como el espejo anatómico del desempate maxilar (molar-molar-incisivo), aplicado a la arcada mandibular utilizando los mismos tipos de dientes en las posiciones correspondientes. No se identificó ningún estudio publicado sobre microbiota subgingival en pacientes ortodóncicos que utilizara una regla de desempate mandibular idéntica; por lo tanto, la regla se preespecifica y documenta aquí como una decisión de protocolo definida por el investigador. Los mismos tres sitios índice por arcada se utilizan en T1 y T2.

   - MONITORIZACIÓN DEL CUMPLIMIENTO Y PROTOCOLO DE ABANDONO

   El cumplimiento del uso del alineador (objetivo 22 horas/día o más) se evalúa mediante autoinforme en cada visita del estudio. Los participantes que informan un cumplimiento inferior a 22 horas/día en dos o más visitas consecutivas se retiran del estudio y sus datos se excluyen del análisis por protocolo. Una sola visita con incumplimiento informado desencadena refuerzo verbal y se registra como una desviación del protocolo. Todos los participantes inscritos se incluyen en una descripción por intención de tratar independientemente del estado de cumplimiento. En T0: seis conos de papel (tres por arcada) se combinan todos en un tubo Eppendorf (200 ul de PBS estéril) - un tubo total por participante al inicio. En T1 y T2: tres conos de papel por arcada se combinan en tubos Eppendorf separados por arcada (arcada con diseño supragingival y arcada con diseño yuxtagingival), etiquetados con código de participante, punto temporal y designación de arcada - dos tubos por participante por punto temporal. Los tubos se congelan a -20 grados C en un plazo de 2-4 horas en la Clínica Aorys, Sibiu. Las muestras se transportan en lotes al Departamento de Microbiología, UMFST Targu Mures, en contenedores aislados con paquetes de gel congelados (transporte aproximadamente 2-2.5 horas). El almacenamiento a -20 grados C antes del análisis es consistente con protocolos validados para la preservación de ADN bacteriano subgingival.

   - ANÁLISIS DE LABORATORIO

   Las muestras se analizan en el Departamento de Microbiología, Universidad de Medicina, Farmacia, Ciencia y Tecnología George Emil Palade de Targu Mures y Hospital Clínico del Condado de Mures, utilizando el kit PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italia; REF T01707-96-S; IVD marcado CE). Extracción de ADN: Los conos de papel se agitan en vórtex en PBS (30 segundos) para eluir bacterias. La suspensión se centrifuga (12,000 x g, 2-3 minutos), se elimina el sobrenadante y se extrae el ADN bacteriano del pellet utilizando un kit de extracción comercial (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, o kit validado equivalente) según las instrucciones del fabricante. PCR en tiempo real: El ensayo PeriodontScreen Real-TM detecta y cuantifica siete especies de patógenos periodontales utilizando sondas fluorescentes específicas (canal FAM, 40 ciclos; canal HEX control interno). Umbrales de significancia clínica validados por el kit: A. actinomycetemcomitans 10^4 copias/reacción o más; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 o más; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 o más. Un resultado es positivo para un patógeno dado cuando el Ct FAM es menor que 35. Un resultado se considera válido cuando el Ct FAM es menor que 35 (independientemente del valor Ct HEX), o cuando el Ct HEX es menor que 35. Un resultado se considera inválido y debe repetirse cuando tanto el Ct FAM como el Ct HEX son mayores que 35 o ausentes, indicando posible fallo de extracción o inhibición de la PCR. El personal de laboratorio recibe tubos codificados (código de participante, arcada, punto temporal) sin conocimiento de qué arcada corresponde a qué diseño de línea de recorte. Además, el recolector de muestras (un especialista en odontología general y residente de ortodoncia, separado del clínico tratante) está completamente cegado a la asignación de arcada en todos los puntos temporales: el recolector realiza todo el muestreo subgingival sin conocimiento de qué diseño de línea de recorte está asignado a cada arcada. El clínico tratante (IP) conserva la clave de asignación, liberada solo después de completar todos los análisis de PCR.

   - ANÁLISIS ESTADÍSTICO

   Análisis primario confirmatorio: El endpoint confirmatorio es la puntuación de carga patógena a nivel de arcada (0-7) en T2 (8 semanas). Una única prueba de rangos con signo de Wilcoxon (pareada, bilateral, alfa = 0.05) comparará las puntuaciones de arcada supragingival versus yuxtagingival en T2. Esta prueba se seleccionó porque el resultado es un recuento ordinal discreto (enteros 0-7) en un diseño de boca dividida pareado, para el cual la comparación pareada no paramétrica es apropiada y no requiere suposiciones distribucionales. Una única prueba confirmatoria en T2 está preespecificada para controlar la tasa de error tipo I en alfa = 0.05 sin corrección por multiplicidad.

   - Análisis de apoyo en T1: La prueba de rangos con signo de Wilcoxon también se aplicará en T1 (4 semanas) como un análisis de apoyo, no confirmatorio, para caracterizar el patrón temporal de cualquier efecto observado. Los resultados en T1 se reportarán descriptivamente; no se extraerá inferencia confirmatoria de la prueba T1.

   Análisis ajustado: Se ajustará un modelo de Ecuaciones de Estimación Generalizadas (GEE) a las puntuaciones de carga patógena a nivel de arcada en T1 y T2, con la siguiente especificación: (1) respuesta: puntuación de carga patógena a nivel de arcada (0-7); (2) función de enlace: identidad; (3) familia de distribución: Gaussiana; (4) estructura de correlación de trabajo: intercambiable, apropiada para dos puntos temporales posteriores al basal con correlación intra-sujeto igual asumida a lo largo del tiempo; (5) covariables: diseño de línea de recorte (binario: supragingival vs. yuxtagingival), punto temporal (categórico: T1, T2), magnitud de intrusión planificada por arcada (continua, mm). Se probará el término de interacción diseño x punto temporal para evaluar si el efecto del diseño de línea de recorte difiere entre T1 y T2; si el término de interacción no es estadísticamente significativo (p > 0.10), se eliminará y se reportará un modelo solo de efectos principales. El modelo GEE tiene en cuenta la correlación intra-sujeto a lo largo de los puntos temporales y ajusta por la variable de asignación no aleatoria preespecificada (magnitud de intrusión planificada). Los análisis GEE se realizarán utilizando el paquete geepack en R (versión 4.0 o posterior).

   • Análisis exploratorio: Prueba de McNemar comparando la positividad del complejo rojo a nivel de arcada (resultado binario) entre los dos diseños en T1 y T2. Interpretado solo descriptivamente; no se extraerá inferencia confirmatoria. La potencia anticipada para este resultado exploratorio es aproximadamente del 22%, debido a la baja prevalencia esperada de positividad simultánea del complejo rojo en participantes periodontalmente sanos. Esta baja potencia se reconoce y el resultado se registra como exploratorio en consecuencia.
   • Datos faltantes: Los datos de resultado faltantes se manejarán mediante análisis de casos completos. Los participantes con datos evaluables tanto en T1 como en T2 constituirán la población por protocolo utilizada en el análisis confirmatorio. Todos los participantes inscritos, incluidos aquellos que se retiran después de T0, se describirán en la población por intención de tratar; no se realizará imputación para el análisis primario, dada la tasa de abandono anticipada del 10% o menos.
   • Software: El análisis confirmatorio primario (prueba de rangos con signo de Wilcoxon) y las estadísticas descriptivas se realizarán utilizando GraphPad Prism 8 (versión 8.0.2). Los modelos GEE se realizarán en R (versión 4.0 o posterior). Todos los valores p reportados son bilaterales. No se planean análisis intermedios.
   • JUSTIFICACIÓN DEL TAMAÑO MUESTRAL

   El tamaño muestral se determinó mediante simulación de Monte Carlo (10,000 iteraciones) para un diseño pareado intra-sujeto (boca dividida). Los parámetros de simulación se seleccionaron de manera conservadora en ausencia de datos piloto publicados específicamente sobre los efectos del diseño de línea de recorte en la carga patógena subgingival:

(1) diferencia clínicamente significativa mínima entre arcadas: 0.5 especies por encima del umbral, representando una especie patógena adicional que cruza el umbral de significancia clínica en la arcada supragingival en comparación con la yuxtagingival; (2) desviación estándar de las puntuaciones individuales a nivel de arcada (sigma): 0.88, lo que implica una desviación estándar de diferencias pareadas (sigma_D) de 0.964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0.88 x sqrt(1.2) = 0.964]; esto representa una estimación conservadora de la variabilidad entre participantes en ausencia de datos piloto; las diferencias pareadas se simularon como aproximadamente simétricas (cópula Gaussiana con marginales normales), que es una línea base conservadora para la estimación de potencia de Wilcoxon; (3) correlación intra-sujeto rho = 0.4, consistente con valores reportados para estudios microbiológicos periodontales de boca dividida; (4) alfa bilateral = 0.05; (5) prueba de rangos con signo de Wilcoxon.

La simulación produjo una potencia estimada = 82.7% (primaria) y 82.3% (verificación independiente), con error tipo I empírico = 5.0%, en n = 35 participantes evaluables. Para tener en cuenta una tasa de abandono anticipada de aproximadamente el 10% (pérdida de seguimiento, incumplimiento con uso de alineador de 22 h/día, desviaciones del protocolo), se estableció un objetivo de inscripción de 39 participantes.

- LIMITACIONES

El kit PeriodontScreen Real-TM se validó para poblaciones con enfermedad periodontal activa; sus umbrales de significancia clínica pueden no estar completamente calibrados para el estado periodontal sano de los participantes inscritos. Los resultados se interpretarán en consecuencia.

La regla de asignación no aleatoria introduce potencial de confusión biomecánica a nivel de arcada más allá de la magnitud de intrusión planificada (por ejemplo, correcciones de torque, movimientos transversales), que no están completamente capturados por la covariable GEE. La magnitud de intrusión planificada por arcada se registra y ajusta como una covariable continua en el modelo GEE; no se puede excluir la confusión biomecánica residual de otros tipos de movimiento.

Debido a que el espécimen T0 representa una muestra bilateral combinada, las puntuaciones basales de patógenos específicas por arcada no están disponibles. Por lo tanto, el análisis primario compara las puntuaciones específicas por arcada en T1 y T2 directamente, sin ajuste por valores basales individuales a nivel de arcada. Esta limitación se mitiga por el criterio de inclusión de estado periodontal clínicamente sano al inicio (profundidad de sondaje de 3 mm o menos, sin sangrado al sondaje en los sitios índice), lo que minimiza la probabilidad de asimetría microbiológica a nivel de arcada preexistente antes de la intervención.