Influence de la conception de la terminaison marginale des gouttières orthodontiques sur le microbiote parodontal sous-gingival pendant le traitement orthodontique : une étude en bouche divisée. (PATHO-ALIGN)

- CONTEXTE ET RAISONNEMENT

La thérapie par aligneurs transparents est largement utilisée en orthodontie. Deux conceptions de ligne de coupe sont couramment employées pendant la phase de finition. La conception supra-gingivale utilise une coupe horizontale droite positionnée environ 2 mm apicalement à la marge gingivale libre : le bord de l'aligneur recouvre environ 2 mm de tissu gingival avec un contact direct mais ne pénètre pas dans le sulcus gingival. La conception festonnée juxta-gingivale utilise une coupe festonnée qui suit exactement le contour naturel de la marge gingivale libre, se terminant au niveau de la marge gingivale sans recouvrir le tissu gingival et sans pénétrer dans le sulcus. Les deux conceptions diffèrent fondamentalement dans leur relation avec la marge gingivale. La conception supra-gingivale crée un microenvironnement semi-fermé à l'entrée du sulcus : en recouvrant 2 mm de tissu gingival, l'aligneur limite l'accès de la salive et de l'oxygène atmosphérique à la région de l'entrée du sulcus. La réduction du débit salivaire et la diminution de la tension en oxygène sont des conditions établies qui favorisent la croissance bactérienne anaérobie dans l'environnement parodontal. Le fait que 2 mm de recouvrement du tissu gingival par le bord de l'aligneur soient suffisants pour produire un changement mesurable de la tension en oxygène sulculaire ou du débit salivaire n'a pas été directement démontré et constitue l'hypothèse biologique étudiée. La conception juxta-gingivale, suivant le contour gingival à sa marge, laisse l'entrée du sulcus plus accessible à la salive et à l'oxygène, maintenant potentiellement des conditions moins favorables à la colonisation anaérobie. Ces différences microenvironnementales n'ont pas été étudiées dans les publications. Aucune étude antérieure n'a examiné si la géométrie de la ligne de coupe affecte la composition du microbiote parodontal sous-gingival chez les patients suivant une thérapie par aligneurs.

• CONCEPTION DE L'ÉTUDE

Il s'agit d'une étude interventionnelle prospective, longitudinale, intra-individuelle (bouche divisée). Chaque participant reçoit simultanément les deux conceptions de ligne de coupe : supra-gingivale sur une arcade dentaire et festonnée juxta-gingivale sur l'arcade controlatérale. Le design bouche divisée contrôle la variation interindividuelle de l'état de santé systémique, de l'hygiène bucco-dentaire, de la composition salivaire et de l'état microbiologique de base. Le matériau de l'aligneur (CA Pro tri-couche, SCHEU-DENTAL GmbH, Iserlohn, Allemagne ; thermoplastique marqué CE) est identique pour les deux conceptions ; seule la géométrie de la ligne de coupe diffère.

• RÈGLE D'AFFECTATION (NON RANDOMISÉE)

L'affectation suit une règle hiérarchique pré-spécifiée documentée avant l'inclusion :

1. Critère principal : L'arcade dentaire avec la plus grande magnitude d'intrusion dentaire planifiée (mm, à partir de la mise en place numérique du traitement avant la fabrication) reçoit la conception supra-gingivale, cohérente avec son indication clinique pour la transmission de force verticale.

2. Critère de départage (intrusion planifiée égale ou nulle sur les deux arcades) : Une séquence systématique alternée pré-spécifiée dans l'ordre d'inclusion. Le premier participant répondant à ce critère reçoit la conception supra-gingivale sur l'arcade maxillaire ; le second sur l'arcade mandibulaire ; et ainsi de suite. Cela garantit un équilibre approximatif de 50/50 dans la distribution au niveau de l'arcade et empêche la confusion au niveau de l'arcade. La magnitude d'intrusion planifiée par arcade est enregistrée comme covariable continue dans tous les modèles statistiques.

   - ÉVALUATION DE BASE (T0)

   Un échantillon de base unique regroupé est collecté en prélevant trois sites index par arcade (six pointes de papier au total : trois par arcade), combinés dans un tube Eppendorf à T0. Cela est justifié par l'hypothèse fondamentale du design bouche divisée : chez les participants avec un état parodontal cliniquement sain à la base (critère d'inclusion : profondeur de sondage de 3 mm ou moins, pas de SPS aux sites index), aucune différence microbiologique cliniquement significative spécifique à l'arcade n'est attendue avant toute intervention. Le microbiome sous-gingival des individus parodontalement sains reflète le réservoir salivaire commun partagé par les deux arcades. L'échantillon T0 caractérise l'état pathogène de base global. La comparaison principale entre les bras est menée uniquement à T1 et T2, où des échantillons spécifiques à l'arcade sont disponibles.

   - TOTAL DES ÉCHANTILLONS : 175 tubes PCR (35 participants évaluables x 5 tubes par participant : 1 regroupé à T0 + 2 spécifiques à l'arcade à T1 + 2 spécifiques à l'arcade à T2). Total des pointes de papier : 525 (35 x 15 : 6 à T0 [3 par arcade x 2 arcades regroupées] + 3 à T1 par arcade x 2 arcades + 3 à T2 par arcade x 2 arcades). L'unité d'analyse PCR reste un résultat par arcade par point temporel ; le regroupement de trois pointes de papier par arcade augmente le matériel biologique par tube et améliore la sensibilité PCR sans changer l'unité analytique ou le calcul de puissance.

   - PROCÉDURE DE COLLECTE D'ÉCHANTILLONS

   Toutes les collectes sont effectuées dans des conditions standardisées de jeûne (à jeun) : les participants s'abstiennent de manger, de boire (eau permise), de se brosser les dents, d'utiliser un bain de bouche et de retirer l'aligneur pendant au moins 8 heures avant la collecte (port nocturne de l'aligneur). Les collectes ont lieu le matin. À chaque visite, la plaque supra-gingivale est doucement retirée de chaque dent index avec une curette stérile sans pénétrer dans le sulcus, et la zone est isolée avec des rouleaux de coton. Trois pointes de papier stériles (taille #25, comme spécifié par le kit Sacace PeriodontScreen Real-TM) sont insérées séquentiellement dans les trois sites index par arcade, chacune maintenue en place pendant 10-20 secondes. Les trois pointes de papier de la même arcade sont immédiatement regroupées dans un seul tube Eppendorf (200 ul de PBS stérile), donnant un échantillon biologique par arcade par point temporel.

   - SÉLECTION DES SITES INDEX (pré-spécifiée, enregistrée à T0, inchangée à T1 et T2) : Règle principale : Les trois sites avec la plus grande profondeur de sondage au sein de chaque arcade sont sélectionnés comme sites index, quelle que soit leur zone anatomique (antérieure, prémolaire ou molaire). Les trois sites peuvent être dans la même zone si ce sont les plus profonds. Critère de départage - Arcade maxillaire (lorsque deux sites ou plus partagent la plus grande profondeur de sondage et que moins de trois sites les plus profonds uniques peuvent être distingués) : mésial de la dent 1.6 + mésial de la dent 2.6 + central de la dent 1.1. Cette sélection est cohérente avec les sites de prélèvement maxillaires utilisés par Lombardo et al. (2021), qui ont collecté des échantillons sous-gingivaux à partir de la première molaire supérieure droite et de l'incisive centrale supérieure droite. Critère de départage - Arcade mandibulaire : mésial de la dent 4.6 + mésial de la dent 3.6 + central de la dent 4.1. Cette règle est définie a priori par l'investigateur comme le miroir anatomique du critère de départage maxillaire (molaire-molaire-incisive), appliqué à l'arcade mandibulaire en utilisant les mêmes types de dents dans les positions correspondantes. Aucune étude publiée sur le microbiote sous-gingival chez les patients orthodontiques n'a été identifiée utilisant une règle de départage mandibulaire identique ; la règle est donc pré-spécifiée et documentée ici comme une décision de protocole définie par l'investigateur. Les trois mêmes sites index par arcade sont utilisés à T1 et T2.

   - SUIVI DE L'OBSERVANCE ET PROTOCOLE D'ABANDON

   L'observance du port de l'aligneur (cible 22 heures/jour ou plus) est évaluée par auto-déclaration à chaque visite d'étude. Les participants qui déclarent une observance inférieure à 22 heures/jour à deux visites consécutives ou plus sont retirés de l'étude et leurs données sont exclues de l'analyse per-protocole. Une seule visite avec non-observance déclarée déclenche un renforcement verbal et est enregistrée comme un écart au protocole. Tous les participants inclus sont décrits dans une analyse en intention de traiter quel que soit leur statut d'observance. À T0 : six pointes de papier (trois par arcade) sont toutes regroupées dans un tube Eppendorf (200 ul de PBS stérile) - un tube total par participant à la base. À T1 et T2 : trois pointes de papier par arcade sont regroupées dans des tubes Eppendorf séparés par arcade (arcade avec conception supra-gingivale et arcade avec conception juxta-gingivale), étiquetés avec le code du participant, le point temporel et la désignation de l'arcade - deux tubes par participant par point temporel. Les tubes sont congelés à -20 degrés C dans les 2-4 heures à la clinique Aorys, Sibiu. Les échantillons sont transportés par lots au département de microbiologie, UMFST Targu Mures, dans des conteneurs isolés avec des blocs de gel congelés (transport environ 2-2,5 heures). Le stockage à -20 degrés C avant analyse est cohérent avec les protocoles validés pour la préservation de l'ADN bactérien sous-gingival.

   - ANALYSE DE LABORATOIRE

   Les échantillons sont analysés au département de microbiologie, Université de Médecine, Pharmacie, Sciences et Technologie George Emil Palade de Targu Mures et à l'Hôpital Clinique du Comté de Mures, en utilisant le kit PeriodontScreen Real-TM (Sacace Biotechnologies Srl, Via Scalabrini 44, 22100 Como, Italie ; REF T01707-96-S ; IVD marqué CE). Extraction d'ADN : Les pointes de papier sont vortexées dans du PBS (30 secondes) pour éluire les bactéries. La suspension est centrifugée (12 000 x g, 2-3 minutes), le surnageant est retiré, et l'ADN bactérien est extrait du culot en utilisant un kit d'extraction commercial (QIAamp DNA Mini Kit, Qiagen, ou kit validé équivalent) selon les instructions du fabricant. PCR en temps réel : Le test PeriodontScreen Real-TM détecte et quantifie sept espèces de pathogènes parodontaux en utilisant des sondes fluorescentes spécifiques (canal FAM, 40 cycles ; contrôle interne canal HEX). Seuils de signification clinique validés par le kit : A. actinomycetemcomitans 10^4 copies/réaction ou plus ; P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola 10^5 ou plus ; P. endodontalis, F. nucleatum, P. intermedia 10^6 ou plus. Un résultat est positif pour un pathogène donné lorsque le Ct FAM est inférieur à 35. Un résultat est considéré comme valide lorsque le Ct FAM est inférieur à 35 (quelle que soit la valeur du Ct HEX), ou lorsque le Ct HEX est inférieur à 35. Un résultat est considéré comme invalide et doit être répété lorsque le Ct FAM et le Ct HEX sont tous deux supérieurs à 35 ou absents, indiquant un échec possible d'extraction ou une inhibition de la PCR. Le personnel de laboratoire reçoit des tubes codés (code du participant, arcade, point temporel) sans savoir quelle arcade correspond à quelle conception de ligne de coupe. De plus, le collecteur d'échantillons (un spécialiste en dentisterie générale et résident en orthodontie, distinct du clinicien traitant) est complètement aveugle à l'affectation des arcades à tous les points temporels : le collecteur effectue tous les prélèvements sous-gingivaux sans savoir quelle conception de ligne de coupe est assignée à chaque arcade. Le clinicien traitant (PI) conserve la clé d'affectation, dévoilée seulement après que toutes les analyses PCR sont terminées.

   - ANALYSE STATISTIQUE

   Analyse primaire confirmatoire : L'objectif confirmatoire est le score de charge pathogène au niveau de l'arcade (0-7) à T2 (8 semaines). Un seul test de Wilcoxon des rangs signés (apparié, bilatéral, alpha = 0,05) comparera les scores des arcades supra-gingivale et juxta-gingivale à T2. Ce test a été sélectionné car le résultat est un compte ordinal discret (entiers 0-7) dans un design bouche divisée apparié, pour lequel une comparaison appariée non paramétrique est appropriée et ne nécessite pas d'hypothèses de distribution. Un seul test confirmatoire à T2 est pré-spécifié pour contrôler le taux d'erreur de type I à alpha = 0,05 sans correction pour la multiplicité.

   - Analyse de soutien à T1 : Le test de Wilcoxon des rangs signés sera également appliqué à T1 (4 semaines) comme analyse de soutien, non confirmatoire, pour caractériser le schéma temporel de tout effet observé. Les résultats à T1 seront rapportés de manière descriptive ; aucune inférence confirmatoire ne sera tirée du test T1.

   Analyse ajustée : Un modèle d'équations d'estimation généralisées (GEE) sera ajusté aux scores de charge pathogène au niveau de l'arcade à T1 et T2, avec la spécification suivante : (1) réponse : score de charge pathogène au niveau de l'arcade (0-7) ; (2) fonction de lien : identité ; (3) famille de distribution : gaussienne ; (4) structure de corrélation de travail : échangeable, appropriée pour deux points temporels post-base avec une corrélation intra-sujet égale supposée dans le temps ; (5) covariables : conception de ligne de coupe (binaire : supra-gingivale vs juxta-gingivale), point temporel (catégoriel : T1, T2), magnitude d'intrusion planifiée par arcade (continue, mm). Le terme d'interaction conception x point temporel sera testé pour évaluer si l'effet de la conception de ligne de coupe diffère entre T1 et T2 ; si le terme d'interaction n'est pas statistiquement significatif (p > 0,10), il sera supprimé et un modèle avec seulement les effets principaux sera rapporté. Le modèle GEE tient compte de la corrélation intra-sujet entre les points temporels et ajuste pour la variable d'affectation non randomisée pré-spécifiée (magnitude d'intrusion planifiée). Les analyses GEE seront effectuées en utilisant le package geepack dans R (version 4.0 ou ultérieure).

   • Analyse exploratoire : Test de McNemar comparant la positivité du complexe rouge au niveau de l'arcade (résultat binaire) entre les deux conceptions à T1 et T2. Interprété uniquement de manière descriptive ; aucune inférence confirmatoire ne sera tirée. La puissance anticipée pour ce résultat exploratoire est d'environ 22%, en raison de la faible prévalence attendue de la positivité simultanée du complexe rouge chez les participants parodontalement sains. Cette faible puissance est reconnue et le résultat est enregistré comme exploratoire en conséquence.
   • Données manquantes : Les données de résultat manquantes seront traitées par analyse des cas complets. Les participants avec des données évaluables à la fois à T1 et T2 constitueront la population per-protocole utilisée dans l'analyse confirmatoire. Tous les participants inclus, y compris ceux qui se retirent après T0, seront décrits dans la population en intention de traiter ; aucune imputation ne sera effectuée pour l'analyse primaire, compte tenu du taux d'abandon anticipé de 10% ou moins.
   • Logiciel : L'analyse confirmatoire primaire (test de Wilcoxon des rangs signés) et les statistiques descriptives seront effectuées en utilisant GraphPad Prism 8 (version 8.0.2). Les modèles GEE seront effectués dans R (version 4.0 ou ultérieure). Toutes les valeurs p rapportées sont bilatérales. Aucune analyse intermédiaire n'est planifiée.
   • JUSTIFICATION DE LA TAILLE D'ÉCHANTILLON

   La taille d'échantillon a été déterminée par simulation de Monte Carlo (10 000 itérations) pour un design intra-sujet apparié (bouche divisée). Les paramètres de simulation ont été sélectionnés de manière conservatrice en l'absence de données pilotes publiées spécifiquement sur les effets de la conception de ligne de coupe sur la charge pathogène sous-gingivale :

(1) différence cliniquement significative minimale entre les arcades : 0,5 espèce au-dessus du seuil, représentant une espèce pathogène supplémentaire franchissant le seuil de signification clinique dans l'arcade supra-gingivale par rapport à l'arcade juxta-gingivale ; (2) écart-type des scores individuels au niveau de l'arcade (sigma) : 0,88, impliquant un écart-type des différences appariées (sigma_D) de 0,964 [sigma_D = sigma x sqrt(2 x (1 - rho)) = 0,88 x sqrt(1,2) = 0,964] ; cela représente une estimation conservatrice de la variabilité inter-participants en l'absence de données pilotes ; les différences appariées ont été simulées comme approximativement symétriques (copule gaussienne avec marginales normales), ce qui est une base conservatrice pour l'estimation de la puissance de Wilcoxon ; (3) corrélation intra-sujet rho = 0,4, cohérente avec les valeurs rapportées pour les études microbiologiques parodontales bouche divisée ; (4) alpha bilatéral = 0,05 ; (5) test de Wilcoxon des rangs signés.

La simulation a donné une puissance estimée = 82,7% (primaire) et 82,3% (vérification indépendante), avec une erreur de type I empirique = 5,0%, à n = 35 participants évaluables. Pour tenir compte d'un taux d'abandon anticipé d'environ 10% (perte de suivi, non-observance du port de l'aligneur 22 h/jour, écarts au protocole), une cible d'inclusion de 39 participants a été fixée.

- LIMITATIONS

Le kit PeriodontScreen Real-TM a été validé pour les populations avec une maladie parodontale active ; ses seuils de signification clinique peuvent ne pas être entièrement calibrés pour l'état parodontal sain des participants inclus. Les résultats seront interprétés en conséquence.

La règle d'affectation non randomisée introduit un potentiel de confusion biomécanique au niveau de l'arcade au-delà de la magnitude d'intrusion planifiée (par exemple, corrections de torque, mouvements transversaux), qui ne sont pas entièrement capturés par la covariable GEE. La magnitude d'intrusion planifiée par arcade est enregistrée et ajustée comme covariable continue dans le modèle GEE ; une confusion biomécanique résiduelle due à d'autres types de mouvement ne peut être exclue.

Parce que l'échantillon T0 représente un échantillon bilatéral regroupé, les scores pathogènes de base spécifiques à l'arcade ne sont pas disponibles. L'analyse primaire compare donc directement les scores spécifiques à l'arcade à T1 et T2, sans ajustement pour les valeurs de base individuelles au niveau de l'arcade. Cette limitation est atténuée par le critère d'inclusion d'un état parodontal cliniquement sain à la base (profondeur de sondage de 3 mm ou moins, pas de saignement au sondage aux sites index), ce qui minimise la probabilité d'une asymétrie microbiologique préexistante au niveau de l'arcade avant l'intervention.