혈액 DNA를 이용한 세균 감염 진단

현재 연구의 목표는 임상적으로 세균 감염이 의심되는 ICU 환자에서 세균 DNA의 혈장 검출의 진단적 가치를 평가하는 것입니다.

ACCP/SCCM 전문가 패널의 패혈증 증후군 정의. 용어 정의 기준 감염 정상적으로 멸균된 조직의 미생물에 의한 침입

전신 염증 반응 증후군(SIRS) 다음 기준 4개 중 최소 2개:

• 온도 > 38°C 또는 < 36°C
• 심박수 > 90비트/분
• 빈호흡 > 20/분 또는 PaCO2 < 32mmHg
• WBC 수 > 12 000/mm3 또는 < 4 000/mm3 감염 과정과 관련된 패혈증 SIRS

중증 패혈증 다음을 동반한 패혈증:

• 동맥 저혈압(SBP<90mmHg, MAP<70 또는 SBP 감소 <40mmHg)
• 또는 기타 장기 기능 장애:
• PaO2/FiO2 < 250(폐렴의 경우 < 200)
• 핍뇨(최소 2시간 동안 < 0,5 ml/kg/h)
• 고유산혈증(> 3mmol/l)
• 혈소판 수 < 80000/mm3 패혈성 쇼크 적절한 수액 소생술과 승압제 지원(에피네프린 또는 노르에피네프린)이 필요함에도 불구하고 지속되는 저혈압(> 1시간)이 있는 중증 패혈증.

SBP: 전신 혈압, MAP: 평균 동맥 혈압,

모든 코드와 정의는 연구가 시작되기 전에 설정됩니다. 다음 정보가 기록됩니다: 연령 및 성별, 입원 범주(의료, 예정된 수술 또는 예정되지 않은 수술), 출신(가정, 병동 또는 응급실), McCabe 점수, ICU 및 병원 사망률. 질병의 중증도는 ICU 첫 날 SAPS II(Simplified Acute Physiology Score), SOFA(Sepsis-related Organ Failure Assessment) 점수, APACHE(Acute Physiologic and Chronic Health Evaluation) II 점수를 사용하여 평가했습니다. Knaus 척도 정의는 호흡기, 심장, 간, 신장 및 면역 체계 부전을 포함한 기존의 만성 장기 부전을 기록하는 데 사용되었습니다.

질병 통제 센터에서 개발한 표준 정의에 따라 감염의 유무를 문서화했습니다. 1. 문서화된 감염이 있는 환자 2. 문서화된 감염이 없는 환자 및 3. 의심되지만 문서화된 감염이 없는 환자.

연구 프로토콜 4개 센터가 참여합니다(전체 65개 병상). 일상적인 임상 실험실 측정에 사용되는 임상 C-반응성 단백질(CRP) 및 프로칼시토닌(PCT) 측정과 함께 두 개의 혈액 샘플(각각 4.5mL)이 수집됩니다. CRP 및 PCT는 감염성 SIRS와 비감염성 SIRS를 구별하는 데 도움이 되도록 환자가 세 ICU 모두에서 SIRS 기준을 충족할 때 일상적으로 수집됩니다. EDTA의 전혈 1개는 세균/진균 DNA 검출을 위해 신속하게 처리됩니다. (분석할 때까지 동결하거나 72시간 이내에 샘플을 4°C로 유지).

Gel과 dipotassium EDTA가 포함된 튜브를 사용하는 두 번째 샘플은 원심분리(4°C에서 10분 동안 1500g) 후 조작 없이 (백혈구 및 적혈구) 혈액 세포에서 혈장을 분리하여 간호사의 직업적 노출 위험을 낮춥니다. 그런 다음 혈장은 분석할 때까지 -80°C에서 보관됩니다. 채혈은 SIRS 기준이 입원 시 또는 ICU 체류 중 이후에 충족될 때 수행됩니다(슈페린 감염 의심).

세균 및 진균 DNA 검출 세균 및 진균 DNA 검출은 Multiplex PCR 병원체 검출 VYOOTM(SIRS-Lab GmbH, Jena, Germany)을 사용하여 수행될 것이다. VYOO™는 배양 독립적인 병원체 유래 핵산 농도와 다중 PCR 기반 종 검출을 결합합니다. 멀티플렉스 PCR은 ~6시간 이내에 높은 치료 가치의 결과를 제공하고 생명을 위협하는 감염을 유발하는 34종의 박테리아와 6종의 곰팡이와 5개의 가장 빈번한 내성 마커를 검출합니다. 최고의 임상적 타당성을 확보하기 위해 종의 프라이머 선정과 항생제 내성은 패혈성 감염에 대한 국제적 연구 결과를 바탕으로 합니다. 이 시스템은 혈액 배양 또는 대체 NAT 프로토콜보다 오염에 훨씬 덜 민감한 것으로 입증되었으며 증가된 특이성과 민감도를 보장합니다.

VYOO™는 SIRS-Lab의 독점적인 PUREPROVE® 기술을 기반으로 하는 포함된 샘플 준비 시스템 LOOXSTER®로 높은 감도를 달성합니다. LOOXSTER®는 거대한 인간 DNA 배경에서 미량의 박테리아 및 곰팡이 DNA를 특별히 농축합니다. 전체 DNA는 병원체 DNA 내의 명확한 동기를 인식하는 매트릭스 고정 DNA 결합 단백질이 있는 친화성 크로마토그래피 컬럼에 적용됩니다. 인간 배경 DNA의 90% 이상이 제거됩니다. 이 효과는 다운스트림 멀티플렉스 PCR 프로토콜의 감도를 크게 증가시키는 동시에 결과에 도달하는 시간을 단축합니다.

5ml 전혈 내의 병원균 세포는 유리 구슬(직경 0.1/2.5mm)과 용해 장치(예: FastPrep®-24, MP Biomedicals, Solon, OH, USA). 단백질 분해 소화 단계 후 총 DNA는 짧은 스핀 컬럼 프로토콜을 사용하여 분리됩니다. 총 DNA는 적절한 버퍼에 용해되어 LOOXSTER® 스핀 컬럼에 적용됩니다. 최종 박테리아 + 진균/인간 DNA 비율이 크게 증가하고 농축된 병원체 DNA가 다중 PCR에 직접 사용됩니다. 생성된 병원체 특정 앰플리콘은 겔 전기영동으로 시각화되고 현재 병원체 또는 저항의 증거를 위해 VYOOa 특정 DNA 길이 마커와 비교됩니다. 대체 amplicon 속성은 더 높은 수준의 특이성과 민감도를 보장하는 하이브리드화(ATâ 시스템, Clondiag)에 의해 달성됩니다.

ELISA에 의한 사이토카인 검출 혈장 사이토카인(IL-6, 8, 10)의 용량은 상업적으로 이용 가능한 키트(R&D systems, Minneapolis, MN)를 사용하는 ELISA 방법 또는 Bio-Plex Multiplex Cytokine Assay(BioRad Lab., Hercules, 캘리포니아).

내독소 및 펩티도글리칸 검출 내독소 투여를 위해 우리는 Limulus Amebocyte Lysate(LAL) 시약 물(LRW)(Biowhittaker)과 비발열성 피펫 및 팁(Costar)을 사용했습니다. 샘플은 비발열성 96웰 배양 플레이트(Costar)에서 LRW로 희석됩니다. 혈액 샘플은 원심분리 후 세포 펠릿과 혈장 사이에 장벽을 형성하는 젤이 들어 있는 내독소가 없는 튜브에 수집됩니다(Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). 그런 다음 플라즈마는 비발열성 튜브로 옮겨지고 테스트될 때까지 -20°C에서 보관됩니다. 혈장 내 박테리아 내독소의 검출은 Limulus amebocyte lysate 테스트를 방해하고 405nm에서 흡광도를 제공하는 노란색 착색으로 인해 방해를 받지만 억제제의 존재로 인해 방해를 받습니다. 우리는 자홍색을 나타내는 Diazo-coupling Limulus amebocyte lysate 분석을 사용하여 혈장의 배경 흡광도를 극복했습니다(Associates of Cape Cod Inc.). 또한 억제제를 불활성화하기 위해 혈장을 LRW에서 1:4로 희석하고 60°C에서 30분 동안 가열했습니다. 이 희석 및 가열 절차가 혈장에서 최적의 내독소 검출을 허용하는 것으로 나타났습니다. 가열 후, 50 μl의 희석된 혈장을 96-웰 배양 플레이트로 옮기고 동일한 부피의 Limulus amebocyte lysate와 함께 37°C에서 30분 동안 배양했습니다. HCl에 50μl의 아질산나트륨, 50μl의 황산암모늄 및 50μl의 N-(1-나프틸)-에틸렌디아민(NEDA)을 연속적으로 첨가하여 제조업체가 지정한 대로 반응을 중단합니다. 유도체. 광학 밀도는 570nm에서 판독되고 내독소 농도는 내독소 표준 곡선과 비교하여 결정됩니다. 테스트의 검출 한계는 0.02 EU/ml의 엔도톡신입니다.

펩티도글리칸은 Dr. Cavaillon의 연구실에 설치된 새로운 실험 절차에 따라 측정될 것입니다. 그람 양성균과 그람 음성균 모두에서 펩티도글리칸을 검출하는 기술은 이미 패혈증 환자의 혈장에서 펩티도글리칸을 검출하는 것으로 나타났습니다. 특허가 적용되었기 때문에 현재 버전에서 추가 기술 정보를 제공할 수 없지만 가능한 한 빨리 추가될 것입니다.