Diagnóstico de infección bacteriana utilizando ADN sanguíneo

El objetivo del estudio actual es evaluar el valor diagnóstico de la detección de ADN bacteriano en plasma en pacientes de la UCI con sospecha clínica de infección bacteriana.

Definiciones de síndromes sépticos basadas en el panel de expertos de ACCP/SCCM. Términos Criterios de definición Infección Invasión por microorganismos de un tejido normalmente estéril

Síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) Al menos 2 de los 4 criterios siguientes:

• Temperatura > 38°C o < 36°C
• Frecuencia cardíaca > 90 latidos/min
• Taquipnea > 20/min o PaCO2 < 32 mmHg
• Recuento de leucocitos > 12 000/mm3 o < 4 000/mm3 Sepsis SIRS relacionado con un proceso infeccioso

Sepsis severa Sepsis con:

• Hipotensión arterial (PAS < 90 mmHg, PAM < 70 o disminución de PAS < 40 mmHg)
• O cualquier otra disfunción orgánica:
• PaO2/FiO2 < 250 (o < 200 si hay neumonía)
• Oliguria (< 0,5 ml/kg/h durante al menos 2 horas)
• Hiperlactacidemia ( > 3mmol/l)
• Recuento de plaquetas < 80000/mm3 Shock séptico Sepsis grave con hipotensión persistente (> 1 hora) a pesar de la reanimación adecuada con líquidos y que requiere soporte vasopresor (epinefrina o norepinefrina).

PAS: Presión arterial sistémica, PAM: Presión arterial media,

Todos los códigos y definiciones se establecen antes del inicio del estudio. Se registran los siguientes datos: edad y sexo, categoría de ingreso (médico, cirugía programada o cirugía no programada), procedencia (domicilio, planta o urgencias) y puntuación de McCabe, mortalidad en UCI y hospitalaria. La gravedad de la enfermedad se evaluó el primer día en la UCI utilizando la puntuación de fisiología aguda simplificada (SAPS II), la puntuación de evaluación de insuficiencia orgánica relacionada con la sepsis (SOFA) y la puntuación de evaluación de salud crónica y fisiológica aguda (APACHE) II. Las definiciones de la escala de Knaus se utilizaron para registrar fallas orgánicas crónicas preexistentes, incluidas fallas respiratorias, cardíacas, hepáticas, renales y del sistema inmunitario.

La presencia o ausencia de infecciones se documentó de acuerdo con las definiciones estándar desarrolladas por los Centros para el Control de Enfermedades; Determinaremos tres grupos: 1. pacientes con infección documentada 2. pacientes sin infección documentada y 3. pacientes con sospecha de infección pero no documentada.

Protocolo del estudio Participarán cuatro centros (65 camas en total). Junto con las mediciones clínicas de proteína C reactiva (PCR) y procalcitonina (PCT) utilizadas en las mediciones de laboratorio de rutina clínicas, se recolectarán dos muestras de sangre (4,5 ml cada una). La PCR y la PCT se recolectan de forma rutinaria cuando el paciente cumple con los criterios para SIRS en las tres UCI para ayudarnos a distinguir SIRS infeccioso de no infeccioso. Una muestra de sangre completa en EDTA se procesará rápidamente para la detección de ADN bacteriano/fúngico. (congelado hasta el análisis o dentro de las 72 horas conservada la muestra a 4°C).

La segunda muestra utilizando tubos que contienen gel y EDTA dipotásico que permiten la separación después de la centrifugación (1500 g durante 10 minutos a 4 °C) del plasma de los glóbulos (blancos y rojos) sin ninguna manipulación y, por lo tanto, reduce el riesgo de exposición laboral de las enfermeras. Luego, el plasma se almacenará a -80°C hasta su análisis. La extracción de sangre se realizará cuando se cumplan los criterios de SIRS ya sea en el ingreso o más tarde durante la estancia en la UCI (sospecha de sobreinfección).

Detección de ADN bacteriano y fúngico La detección de ADN bacteriano y fúngico se realizará mediante la detección de patógenos Multiplex PCR VYOOTM (SIRS-Lab GmbH, Jena, Alemania). VYOOâ combina la concentración de ácidos nucleicos derivados de patógenos independientes del cultivo y la detección de especies basada en PCR multiplex. La PCR multiplex brinda resultados de alto valor terapéutico en aproximadamente 6 horas y detecta 34 especies bacterianas y 6 fúngicas que causan infecciones potencialmente mortales, así como los cinco marcadores de resistencia más frecuentes. Con el fin de garantizar la máxima validez clínica, la selección inicial de las especies y las resistencias a los antibióticos se basa en los resultados de estudios internacionales sobre infecciones sépticas. Se demostró que el sistema es mucho menos susceptible a las contaminaciones que los hemocultivos o los protocolos NAT alternativos y garantiza una mayor especificidad y sensibilidad.

VYOOâ logra su alta sensibilidad con el sistema de preparación de muestras incluido LOOXSTER® que se basa en la tecnología PUREPROVE® patentada de SIRS-Lab. LOOXSTER® concentra específicamente la cantidad mínima de ADN bacteriano y fúngico de un enorme fondo de ADN humano. El ADN total se aplica en una columna de cromatografía de afinidad con una proteína de unión de ADN inmovilizada en matriz que reconoce motivos definidos dentro del ADN del patógeno. Se elimina más del 90% del ADN de fondo humano. Este efecto aumenta sustancialmente la sensibilidad del protocolo de PCR multiplex aguas abajo y, al mismo tiempo, reduce el tiempo hasta el resultado.

Las células patógenas dentro de 5 ml de sangre completa se rompen mecánicamente utilizando perlas de vidrio (0,1/2,5 mm de diámetro) y un dispositivo de lisis (p. ej. FastPrep®-24, MP Biomedicals, Solon, OH, EE. UU.). Después de un paso de digestión proteolítica, el ADN total se aísla utilizando un protocolo de columna de centrifugado corto. El ADN total se disuelve en un tampón apropiado y se aplica a la columna giratoria LOOXSTER®. La proporción final de ADN bacteriano más fúngico/humano aumenta significativamente y el ADN patógeno concentrado se utiliza directamente para PCR multiplex. Los amplicones específicos de patógenos generados se visualizan mediante electroforesis en gel y se comparan con marcadores de longitud de ADN específicos de VYOOâ para comprobar la presencia de patógenos o resistencias. Una atribución alternativa de amplicón se logra mediante hibridación (sistema ATâ, Clondiag), lo que asegura un mayor grado de especificidad y sensibilidad.

Detección de citocinas mediante ELISA La dosificación de citocinas plasmáticas (IL-6, 8, 10) se realizará mediante métodos ELISA utilizando kits comercialmente disponibles (R&D Systems, Minneapolis, MN) o mediante el ensayo de citocinas Bio-Plex Multiplex (BioRad Lab., Hercules, CALIFORNIA).

Detección de endotoxinas y péptidoglicanos Para la dosificación de endotoxinas, utilizamos agua reactiva (LRW) de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) (Biowhittaker) y pipetas y puntas apirógenas (Costar). Las muestras se diluirán con LRW en placas de cultivo apirógenas de 96 pocillos (Costar). Las muestras de sangre se recogerán en tubos libres de endotoxinas que contienen un gel que, después de la centrifugación, forma una barrera entre el sedimento celular y el plasma (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). Luego, el plasma se transferirá a tubos apirógenos y se mantendrá a -20 °C hasta que se analice. La detección de endotoxina bacteriana en plasma se ve obstaculizada por su coloración amarilla que interfiere con la prueba de lisado de amebocitos de Limulus y proporciona una absorbancia a 405 nm, pero también por la presencia de inhibidores. Superamos la absorbancia de fondo del plasma utilizando un ensayo de lisado de amebocitos de Limulus de acoplamiento diazoico que proporciona una coloración magenta (Associates of Cape Cod Inc.). Además, para inactivar los inhibidores, el plasma se diluyó 1:4 en LRW y se calentó durante 30 min a 60 °C, ya que se ha demostrado que este procedimiento de dilución y calentamiento permite una detección óptima de endotoxinas en plasma. Después del calentamiento, se transfirieron 50 μl de plasma diluido a una placa de cultivo de 96 pocillos y se incubaron con el mismo volumen de lisado de amebocitos de Limulus durante 30 min a 37 °C. La reacción se detendrá, según especifica el fabricante, mediante la adición sucesiva de 50 μl de nitrito de sodio en HCl, 50 μl de sulfamato de amonio y 50 μl de N-(1-naftil)-etilendiamina (NEDA) que forman un magenta diazotado derivado. La densidad óptica se leerá a 570 nm y la concentración de endotoxina se determinará por comparación con una curva estándar de endotoxina. El límite de detección de la prueba es de 0,02 UE/ml de endotoxina.

El peptidoglucano se medirá de acuerdo con un nuevo procedimiento experimental establecido en el laboratorio del Dr. Cavaillon. Ya se ha demostrado que la técnica que detecta peptidoglicano de bacterias Gram-positivas y Gram-negativas detecta peptidoglicano en plasma de pacientes con sepsis. Debido a que se ha solicitado una patente, actualmente no se puede proporcionar más información técnica en la presente versión, pero se agregará lo antes posible.