血液DNAを用いた細菌感染診断

現在の研究の目標は、細菌感染の臨床的疑いがある ICU 患者における細菌 DNA の血漿検出の診断的価値を評価することです。

ACCP/SCCM 専門家パネルに基づく敗血症症候群の定義。 用語 定義基準 感染 正常に無菌の組織への微生物の侵入

全身性炎症反応症候群 (SIRS) 以下の 4 つの基準のうち少なくとも 2 つ:

• 体温 > 38°C または < 36°C
• 心拍数 > 90 拍/分
• 頻呼吸 > 20/分または PaCO2 < 32 mmHg
• 白血球数 > 12,000/mm3 または < 4,000/mm3 感染プロセスに関連する敗血症 SIRS

重度の敗血症 :

• 動脈性低血圧（SBP<90mmHg、MAP<70またはSBP低下<40mmHg）
• またはその他の臓器機能不全 :
• PaO2/FiO2 < 250 (肺炎の場合は < 200)
• 乏尿 (< 0.5 ml/kg/h、少なくとも 2 時間)
• 高乳酸血症 ( > 3mmol/l)
• 血小板数 < 80000/mm3 敗血症性ショック 適切な輸液蘇生と昇圧剤のサポート (エピネフリンまたはノルエピネフリン) が必要であるにもかかわらず、持続する低血圧 (> 1 時間) を伴う重度の敗血症。

SBP：全身血圧、MAP：平均動脈圧、

すべてのコードと定義は、研究開始前に確立されています。 次の情報が記録されます: 年齢と性別、入院カテゴリ (医療、予定された手術、または予定外の手術)、出身地 (自宅、病棟、または緊急治療室)、および McCabe スコア、ICU および病院での死亡率。 病気の重症度は、簡易急性生理学スコア（SAPS II）、敗血症関連臓器不全評価（SOFA）スコア、および急性生理学的および慢性健康評価（APACHE）IIスコアを使用して、ICUの初日に評価されました。 Knaus スケールの定義は、呼吸器、心臓、肝臓、腎臓、および免疫系の障害を含む既存の慢性臓器障害を記録するために使用されました。

感染症の有無は、疾病管理センターによって開発された標準的な定義に従って文書化されました。 3 つのグループを決定します: 1. 感染が記録されている患者 2. 感染が記録されていない患者 3. 感染が疑われるが記録されていない患者。

研究プロトコル 4 つのセンターが参加します (全体で 65 床)。 臨床ルーチンのラボ測定で使用される臨床 C 反応性タンパク質 (CRP) およびプロカルシトニン (PCT) の測定に加えて、2 つの血液サンプル (各 4.5 mL) が収集されます。 CRP と PCT は、患者が 3 つの ICU すべてで SIRS の基準を満たしている場合に定期的に収集され、感染性 SIRS と非感染性 SIRS を区別するのに役立ちます。 EDTA 上の 1 つの全血は、細菌/真菌 DNA 検出のために迅速に処理されます。 (分析まで、または 72 時間以内にサンプルを 4°C で凍結)。

ゲルと二カリウム EDTA を含むチューブを使用した 2 番目のサンプルでは、​​遠心分離 (1500g、4°C で 10 分間) 後に (白血球と赤血球) 血球からの血漿を操作なしで分離できるため、看護師の職業曝露のリスクが低下します。 その後、血漿は分析まで-80℃で保存されます。 採血は、入院時またはその後の ICU 滞在中に SIRS 基準が満たされる場合に実行されます (重複感染の疑い)。

細菌および真菌のＤＮＡ検出 細菌および真菌のＤＮＡ検出は、マルチプレックスＰＣＲ病原体検出ＶＹＯＯＴＭ（ＳＩＲＳ－Ｌａｂ ＧｍｂＨ、イエナ、ドイツ）を用いて行われる。 VEOOâ は、文化に依存しない病原体由来の核酸濃度とマルチプレックス PCR ベースの種の検出を組み合わせたものです。 マルチプレックス PCR は、6 時間以内に高い治療価値の結果をもたらし、生命を脅かす感染症を引き起こす 34 の細菌種と 6 つの真菌種、および最も頻度の高い 5 つの耐性マーカーを検出します。 最高の臨床的妥当性を確保するために、種のプライマー選択と抗生物質耐性は、敗血症感染症に関する国際的な研究結果に基づいています。 このシステムは、血液培養や代替 NAT プロトコルよりも汚染の影響を受けにくいことが証明されており、特異性と感度が確実に向上します。

SIRS-Lab 独自の PUREPROVE® テクノロジーに基づいた付属のサンプル調製システム LOOXSTER® により、VYOO® は高い感度を実現します。 LOOXSTER® は、膨大なヒト DNA バックグラウンドから微量の細菌および真菌 DNA を特異的に濃縮します。 全 DNA は、病原体 DNA 内の明確な動機を認識するマトリックス固定化 DNA 結合タンパク質を含むアフィニティー クロマトグラフィー カラムに適用されます。 ヒトのバックグラウンド DNA の 90% 以上が除去されます。 この効果により、下流のマルチプレックス PCR プロトコルの感度が大幅に向上し、同時に結果が得られるまでの時間が短縮されます。

全血5ml中の病原体細胞は、ガラスビーズ（直径0.1/2.5mm）と溶解装置（例えば、 FastPrep®-24、MP Biomedicals、ソロン、オハイオ州、米国）。 タンパク質分解ステップの後、ショート スピン カラム プロトコルを使用して全 DNA を分離します。 全 DNA を適切なバッファーに溶解し、LOOXSTER® スピンカラムにアプライします。 最終的な細菌と真菌/ヒト DNA の比率は大幅に増加し、濃縮された病原体 DNA はマルチプレックス PCR に直接使用されます。 生成された病原体固有のアンプリコンは、ゲル電気泳動によって可視化され、現在の病原体または耐性の証明のために、VYOOâ 固有の DNA 長マーカーと比較されます。 代替アンプリコンの帰属は、ハイブリダイゼーション (ATâ システム、Clondiag) によって達成され、より高度な特異性と感度が保証されます。

ELISA によるサイトカイン検出 血漿サイトカイン (IL-6、8、10) の用量は、市販のキット (R&D systems、ミネソタ州ミネアポリス) を使用する ELISA 法、または Bio-Plex Multiplex Cytokine Assay (BioRad Lab.、Hercules、 CA）。

エンドトキシンとペプチドグリカンの検出 エンドトキシンの投与には、Limulus Amebocyte Lysate (LAL) 試薬水 (LRW) (Biowhittaker) および非発熱性ピペットとチップ (Costar) を使用しました。 サンプルは、非発熱性 96 ウェル培養プレート (Costar) で LRW で希釈されます。 血液サンプルは、遠心分離後に細胞ペレットと血漿との間にバリアを形成するゲルを含むエンドトキシンフリーのチューブに収集されます（Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ）。 その後、血漿を非パイロジェニックチューブに移し、テストするまで-20°Cに保ちます。 血漿中の細菌エンドトキシンの検出は、Limulus amebocyte lysate テストを妨害し、405 nm での吸光度を与える黄色の着色によって妨げられますが、阻害剤の存在によっても妨げられます。 我々は、マゼンタ色を呈するジアゾカップリングカブトガニアメボサイト溶解物アッセイを使用して、血漿のバックグラウンド吸光度を克服した(ケープコッド社の協会)。 さらに、阻害剤を不活性化するために、血漿を LRW で 1:4 に希釈し、60°C で 30 分間加熱しました。 加熱後、50μlの希釈血漿を96ウェル培養プレートに移し、同量のカブトガニ変形細胞溶解物とともに37℃で30分間インキュベートした。 メーカーの指示に従って、50 μl の HCl 亜硝酸ナトリウム、50 μl のスルファミン酸アンモニウム、および 50 μl の N-(1-ナフチル)-エチレンジアミン (NEDA) を連続的に添加して、ジアゾ化マゼンタを形成することにより、反応を停止します。派生物。 ５７０ｎｍで光学密度を読み取り、エンドトキシン標準曲線と比較してエンドトキシン濃度を決定する。 テストの検出限界はエンドトキシン 0.02 EU/ml です。

ペプチドグリカンは、カヴァイヨン博士の研究室で設定された新しい実験手順に従って測定されます。 グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方からペプチドグリカンを検出する技術は、敗血症患者の血漿中のペプチドグリカンを検出することがすでに示されています。 特許が申請されているため、現在のバージョンでこれ以上の技術情報を提供することはできませんが、できるだけ早く追加されます。