체외에서 수정된 정자 수가 차후 인간 배아 발달에 미치는 영향

배경

인간 체외 수정 절차에서 난모세포는 일반적으로 ml 수정 배지당 50,000~150,000개의 정자 농도로 수정됩니다. 정자 농도를 >200,000/ml로 증가시키면 수정률이 감소하는 것으로 나타났습니다(200,000개/ml로 수정된 그룹에서 66.7% 대 10,000개/ml로 수정된 그룹에서 79,7%). 90,000/ml, p<0,001)(Mahadevan 및 Trounson, 1984). 이러한 결과는 다른 연구에 의해 확인되었습니다(Diamond, Rogers et al., 1985). 수정률이 감소한 이유는 불분명하지만 고농도의 정자 대사 또는 많은 수의 정자와 관련된 분해 산물이 정자와 난모세포의 생존력에 악영향을 미칠 수 있다고 추측됩니다. Dumoulinet al. 1992년에는 정자 농도의 증가가 수정률뿐만 아니라 배아 발달에도 영향을 미친다는 것을 보여주었다(Dumoulin, Bras et al., 1992). 50,000/ml 그룹(65.5%; p<0.05)보다 100,000/ml 그룹(53.4%)에서 2일째에 발견된 빠르게 발달하는 배아(4세포 및 5~8세포 단계)가 현저히 적었습니다. p<0.05 ).

LUFC(Leuven University Fertility Center)에서는 15년 이상 전통적으로 난모세포를 수정하여 발표된 평균 농도(50,000 ~ 200,000 운동성 정자/ml)보다 더 높은 정자 농도(600,000/ml 정자)로 수정했습니다(Chen and Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) 수정에 대한 이러한 높은 농도는 LUFC에서 관찰되는 3일째에 8세포 배아의 낮은 비율의 원인일 수 있습니다. 문학에 비해. LUFC에서는 배아의 20%만이 3일째에 8세포기에 도달합니다. 문헌에서 3일째 8개 세포 배아의 비율은 30~37%인 것으로 보고되었습니다(Chen and Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

이 전향적 무작위 시험에서 우리는 수정 시 정자 농도를 줄임으로써 배아 발달이 개선될 수 있다는 가설을 테스트할 것입니다. 이것은 3일째 배아 발달에 대한 600,000개의 정자/ml로 수정하는 효과를 보여주는 최초의 무작위 시험이 될 것입니다.

재료 및 방법

• 환자 최소 4개의 난모세포를 가진 모든 환자가 이 연구에 포함됩니다. 또한, 연구에 포함하기 위해 픽업 당일 정액 샘플은 처리 후 총 운동성 수가 10 x 106/ml 이상이어야 합니다. 모든 ICSI 환자는 이 연구에서 제외됩니다.
• 무작위화 각 환자에 대해 모든 난모세포는 낮은 수정 농도(150,000/ml) 또는 높은 농도(600,000/ml)에 무작위로 할당됩니다. 무작위화는 "여기에 하나 - 저기에 하나"라는 원칙에 따라 난모세포 검색 시 수행됩니다.
• 파일럿 연구 결과 이 ​​전향적 무작위 연구를 시작하기 전에, 우리는 수정률이 수정 농도 감소에 의해 영향을 받지 않는지 확인하기 위해 파일럿 연구를 수행했습니다. 21명의 환자의 268개의 난모세포가 이 파일럿 연구에 포함되었습니다. 좋은 예후(이전 주기에서 최소 70%의 수정률 및 양호한 정자 매개변수로 정의됨: 처리 후 ml당 최소 10 x 106 운동성 정자 및 최소 60% 운동성 정자로 정의됨)를 가진 환자만 선택되었습니다. 처음에는 수정 농도를 절반으로 줄였습니다. ml당 600,000개 대신 ml당 300,000개의 정자로 수정했을 때 수정률은 크게 변하지 않았습니다(75, 9% 대 68,7%; p<0,05). 파일럿 연구의 두 번째 부분에서 농도는 150,000/ml로 낮아졌습니다. 정자 수가 감소해도 수정률은 감소하지 않았습니다(150,000개 그룹에서 76,6% 대 600,000개 그룹에서 83,6%; p<0,05). 2일째에 양질의 배아 수가 10% 증가한 것으로 나타났습니다(150,000개 그룹에서 53,1% 4세포 배아 대 600,000개 그룹에서 42,6%; p<0,05). 그러나 3일째에 이 소그룹에서 양질의 배아 수의 차이는 관찰되지 않았습니다(150,000개 그룹에서 32.7% 대 600,000개 그룹에서 36.1%; p<0,05). 이 파일럿 연구는 수정을 위해 정자 농도를 낮추는 것이 수정률을 감소시키지 않고 배아 발달에 유익한 영향을 미칠 수 있음을 보여주었지만 이러한 경향을 확인하기 위해 더 많은 환자가 연구되어야 합니다.
• 정자 준비 정자 샘플은 밀도 구배 원심분리 기술을 사용하여 준비됩니다. 샘플을 분리 구배에 로드하고 1450rpm에서 20분 동안 원심분리합니다. 생성된 펠릿을 원심분리에 의해 2회 세척한다. 그 후 펠릿을 0.75ml 수정 배지에 재현탁합니다. 계수 후 샘플을 ml당 10 x 10 운동성 정자의 최종 농도로 희석합니다(이 농도는 수정률이 높은 그룹에 사용되는 농도입니다). 수정률이 낮은 그룹의 경우 정자 샘플을 ml당 운동성 정자 2.5 x 106의 농도로 다시 희석합니다.
• 배아 배양 및 이식 난모세포 흡인 동안 난모세포는 두 그룹으로 나뉩니다. 난모세포는 최대 5개의 난모세포가 있는 750µl 수정 배지에 배치됩니다. 37°C에서 배양한 후 저농도 또는 고농도의 정자 샘플 30 μl를 추가하여 난모세포를 수정합니다. 수정 후 18-20시간 후에 수정을 평가합니다. 배아 품질은 2일, 3일 및 5일(절단 단계, 형태 및 대칭)에 평가됩니다. 수정된 난자의 수와 이전 주기의 수에 따라 배아 이식은 2일, 3일 또는 5일에 수행됩니다. 벨기에 법(Koninklijk Besluit, 1 juli 2003)의 이식 정책에 따라 (분할 단계, 형태 및 대칭에 기반한) 최상의 배아가 자궁으로 이식됩니다. 이식 당일 충분한 품질의 잉여 배아는 모두 동결 보존됩니다.
• 결과 변수 및 검정력 계산 이 연구의 주요 결과 변수는 2일과 3일(7 또는 8 세포기)에 양질의 배아 수로 평가되는 배아 발달입니다. 낮은 수정 농도(150,000/ml 정자)를 가진 그룹에서 7~8개의 세포 배아의 비율이 높은 수정 농도(30%)를 가진 그룹의 비율보다 상당히 높다(40%)는 가설을 테스트하기 위해 ) 검정력 계산 결과 3일째 각 그룹에 299개의 배아가 필요한 것으로 나타났습니다(베타=0.8 및 알파 <0.05). 이 연구의 다른 결과 변수는 수정률, 다정자 발생률, 임신률 및 이식된 배아당 착상률입니다.