Effekt av antalet inseminerade spermier på efterföljande mänsklig embryonal utveckling in vitro

BAKGRUND

Vid in vitro-befruktning hos människor insemineras oocyter vanligtvis med koncentrationer som varierar mellan 50 000 och 150 000 spermier per ml befruktningsmedium. Det har visat sig att en ökning av koncentrationen av spermier till >200 000 per ml resulterar i minskade befruktningshastigheter (66,7 % i gruppen som inseminerades med 200 000 spermier/ml mot 79,7 % i gruppen som inseminerades med 10 000- 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan och Trounson, 1984). Dessa resultat bekräftades av en annan studie (Diamond, Rogers et al., 1985). Orsaken till denna minskade befruktningshastighet är oklar men det har spekulerats i att förekomsten av höga koncentrationer av spermiemetabolism eller nedbrytningsprodukter associerade med ett större antal spermier kan påverka spermier och oocyters livsduglighet negativt. Dumoulin et al. 1992 visade att en ökning av spermiekoncentrationen påverkar inte bara befruktningshastigheten utan även embryonutvecklingen (Dumoulin, Bras et al., 1992). Betydligt färre snabbt utvecklande embryon (4-cells- och 5- till 8-cellsstadier) hittades på dag 2 i 100 000/ml-gruppen (53,4 %) än i 50 000/ml-gruppen (65,5 %; p<0,05 ).

Vid Leuven University Fertility Centre (LUFC) har oocyter inseminerats traditionellt i mer än 15 år nu med en högre spermiekoncentration (600 000/ml spermier) än de publicerade genomsnittskoncentrationerna (50 000 till 200 000 rörliga spermier/ml) (Chen) och Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Denna högre koncentration för inseminationen kan vara orsaken till den lägre andelen 8-cells embryon på dag 3 som observerades vid LUFC när jämfört med litteraturen. På LUFC når endast 20% av embryona 8-cellsstadiet dag 3. I litteraturen har andelen 8 cell embryon på dag 3 rapporterats vara mellan 30 och 37 % (Chen och Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

I denna prospektiva randomiserade studie kommer vi att testa hypotesen att embryonutveckling kan förbättras genom att minska spermiekoncentrationen vid insemination. Detta kommer att vara den första randomiserade studien som visar effekten av inseminering med 600 000 spermier/ml på embryonutvecklingen dag 3.

MATERIAL OCH METODER

• Patienter Alla patienter med minst fyra oocyter kommer att inkluderas i denna studie. Dessutom, för att inkluderas i studien, måste spermaprovet på upptagningsdagen ha en total motilitetsräkning efter bearbetning på minst 10 x 106 /ml. Alla ICSI-patienter kommer att exkluderas från denna studie.
• Randomisering För varje patient kommer alla oocyter att slumpmässigt tilldelas den låga inseminationskoncentrationen (150 000/ml) eller den höga koncentrationen (600 000/ml). Randomiseringen kommer att göras vid tidpunkten för oocythämtning enligt principen "en här - en där".
• Resultat från pilotstudie Innan vi startar denna prospektiva randomiserade studie har vi genomfört en pilotstudie för att kontrollera om befruktningshastigheten inte påverkades av minskningen av inseminationskoncentrationen. 268 oocyter av 21 patienter inkluderades i denna pilotstudie. Endast patienter med god prognos (definierad som en befruktningshastighet på minst 70 % i föregående cykel och bra spermieparametrar: minst 10 x 106 rörliga spermier per ml efter bearbetning och minst 60 % rörliga spermier) valdes ut. Till en början halverades inseminationskoncentrationen. Befruktningshastigheten förändrades inte nämnvärt när vi inseminerade med 300 000 spermier per ml istället för med 600 000 per ml (75, 9% mot 68,7%; p<0,05). I den andra delen av pilotstudien sänktes koncentrationen till 150 000/ml. Det var ingen minskning av befruktningshastigheten med det minskade antalet spermier (76,6 % i 150 000-gruppen mot 83,6 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Dag 2 noterades en 10-procentig ökning av antalet embryon av god kvalitet (53,1 % 4-cells embryon i 150 000-gruppen mot 42,6 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Men på dag 3 observerades ingen skillnad i antalet embryon av god kvalitet i denna lilla grupp (32,7 % i 150 000-gruppen mot 36,1 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Denna pilotstudie visade att en sänkning av spermiekoncentrationen för insemination inte minskar befruktningshastigheten och kan ha en gynnsam effekt på embryonutvecklingen men fler patienter behöver studeras för att bekräfta denna trend
• Spermieberedning Spermaprover prepareras med en densitetsgradientcentrifugeringsteknik. Proverna laddas på en Isolat-gradient och centrifugeras vid 1450 rpm under 20 minuter. Den resulterande pelleten tvättas två gånger genom centrifugering. Därefter återsuspenderas pelleten i 0,75 ml befruktningsmedium. Efter räkning späds provet till en slutlig koncentration av 10 x 106 rörliga spermier per ml (detta är den koncentration som används för gruppen med hög insemination). För gruppen med låg insemination kommer spermieprovet att spädas igen till en koncentration av 2,5 x 106 rörliga spermier per ml.
• Embryoodling och överföring Under oocytaspirationen kommer oocyterna att delas in i två grupper. Oocyterna placeras i 750 µl befruktningsmedium med maximalt 5 oocyter. Efter inkubation vid 37°C insemineras oocyter genom att tillsätta 30 µl av spermieprovet med antingen den låga eller den höga koncentrationen. Befruktningen utvärderas 18-20 timmar efter inseminationen. Embryonkvalitet utvärderas på dag 2, 3 och 5 (klyvningsstadiet, morfologi och symmetri). Beroende på antalet befruktade oocyter och antalet tidigare cykler utförs embryoöverföring på dag 2, 3 eller dag 5. Enligt överföringspolicyn i den belgiska lagen (Koninklijk Besluit, 1 juli 2003) överförs de bästa embryona (baserat på klyvningsstadiet, morfologi och symmetri) till livmodern. På överföringsdagen kryokonserveras alla överskott av embryon av tillräcklig kvalitet.
• Resultatvariabler och kraftberäkning Den primära resultatvariabeln för denna studie är embryonutvecklingen utvärderad av antalet embryon av god kvalitet på dag 2 och dag 3 (i 7- eller 8-cellsstadiet). För att testa hypotesen att andelen 7 till 8 cellembryon i gruppen med den låga inseminationskoncentrationen (150 000/ml spermier) är signifikant högre (40 %) än andelen i gruppen med den höga inseminationskoncentrationen (30 %). ), visade kraftberäkning att 299 embryon behövs i varje grupp på dag 3 (beta=0,8 och alfa <0,05). Andra utfallsvariabler i denna studie är befruktningshastigheten, förekomsten av polyspermi, graviditetsfrekvens och implantationshastighet per överfört embryo.