Effekt av antall inseminerte spermatozoer på påfølgende menneskelig embryonal utvikling in vitro

BAKGRUNN

Ved in vitro-fertiliseringsprosedyrer hos mennesker insemineres oocytter vanligvis med konsentrasjoner som varierer mellom 50 000 og 150 000 sædceller per ml befruktningsmedium. Det har vist seg at å øke konsentrasjonen av sædceller til >200 000 per ml resulterer i reduserte befruktningsrater (66,7 % i gruppen inseminert med 200 000 spermatozoer/ml mot 79,7 % i gruppen inseminert med 10 000- 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan og Trounson, 1984). Disse resultatene ble bekreftet av en annen studie (Diamond, Rogers et al., 1985). Årsaken til denne reduserte befruktningshastigheten er uklar, men det har blitt spekulert i at tilstedeværelsen av høye konsentrasjoner av spermmetabolisme eller nedbrytningsprodukter assosiert med større antall spermatozoer kan ha en negativ innvirkning på sperm og oocytts levedyktighet. Dumoulin et al. 1992 viste at å øke spermkonsentrasjonen påvirker ikke bare befruktningshastigheten, men også embryoutviklingen (Dumoulin, Bras et al., 1992). Signifikant færre raskt utviklende embryoer (4-celle og 5- til 8-celle stadier) ble funnet på dag 2 i 100 000/ml-gruppen (53,4 %) enn i 50 000/ml-gruppen (65,5 %; p<0,05 ).

Ved Leuven University Fertility Centre (LUFC) har oocytter blitt inseminert tradisjonelt i mer enn 15 år nå med en høyere spermkonsentrasjon (600 000/ml spermatozoer) enn gjennomsnittskonsentrasjonene publisert (50 000 til 200 000 bevegelige spermier/ml) (Chen) og Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Denne høyere konsentrasjonen for inseminering kan være årsaken til den lavere frekvensen av 8-celle embryoer på dag 3 observert ved LUFC når sammenlignet med litteraturen. På LUFC når bare 20% av embryoene 8-cellestadiet på dag 3. I litteraturen er andelen av 8 celleembryoer på dag 3 rapportert å være mellom 30 og 37 % (Chen og Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

I denne prospektive randomiserte studien vil vi teste hypotesen om at embryoutvikling kan forbedres ved å redusere spermkonsentrasjonen ved inseminering. Dette vil være den første randomiserte studien som viser effekten av inseminering med 600 000 spermatozoer/ml på embryoutviklingen på dag 3.

MATERIALER OG METODER

• Pasienter Alle pasienter med minst fire oocytter vil bli inkludert i denne studien. Videre, for inkludering i studien, må sædprøven på hentedagen ha et totalt motilitetstall etter bearbeiding på minst 10 x 106 /ml. Alle ICSI-pasienter vil bli ekskludert fra denne studien.
• Randomisering For hver pasient vil alle oocytter tildeles tilfeldig til lav inseminasjonskonsentrasjon (150 000/ml) eller høy konsentrasjon (600 000/ml). Randomiseringen vil bli gjort på tidspunktet for oocyttuthenting etter prinsippet "en her - en der".
• Resultater fra pilotstudie Før vi startet denne prospektive randomiserte studien, har vi gjennomført en pilotstudie for å sjekke om befruktningsraten ikke var påvirket av reduksjonen i inseminasjonskonsentrasjonen. 268 oocytter av 21 pasienter ble inkludert i denne pilotstudien. Kun pasienter med god prognose (definert som en befruktningsrate på minst 70 % i forrige syklus og gode sædparametere: minst 10 x 106 bevegelige spermatozoer per ml etter prosessering og minimalt med 60 % bevegelige spermatozoer) ble valgt. Først ble insemineringskonsentrasjonen halvert. Befruktningsraten endret seg ikke nevneverdig da vi inseminerte med 300 000 sædceller per ml i stedet for med 600 000 per ml (75, 9 % mot 68,7 %; p<0,05). I den andre delen av pilotstudien ble konsentrasjonen senket til 150 000/ml. Det var ingen reduksjon i befruktningsraten med redusert antall sædceller (76,6 % i 150 000-gruppen mot 83,6 % i 600 000-gruppen; p<0,05). På dag 2 ble det lagt merke til en 10 prosent økning i antall embryoer av god kvalitet (53,1 % 4-celle embryoer i 150 000-gruppen mot 42,6 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Men på dag 3 ble det ikke observert noen forskjell i antall embryoer av god kvalitet i denne lille gruppen (32,7 % i 150 000-gruppen mot 36,1 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Denne pilotstudien viste at senking av sædkonsentrasjonen for inseminering ikke reduserer befruktningshastigheten, og kan ha en gunstig effekt på embryoutvikling, men flere pasienter må studeres for å bekrefte denne trenden.
• Spermpreparering Spermprøver tilberedes ved bruk av en tetthetsgradientsentrifugeringsteknikk. Prøvene settes på en Isolate-gradient og sentrifugeres ved 1450 rpm i 20 minutter. Den resulterende pelleten vaskes to ganger ved sentrifugering. Deretter resuspenderes pelleten i 0,75 ml gjødslingsmedium. Etter telling fortynnes prøven til en sluttkonsentrasjon på 10 x 106 bevegelige spermatozoer per ml (dette er konsentrasjonen som brukes for gruppen med høy inseminasjon). For lavinseminasjonsgruppen vil sædprøven fortynnes igjen til en konsentrasjon på 2,5 x 106 bevegelige sædceller per ml.
• Embryokultur og overføring Under oocyttaspirasjonen vil oocyttene deles i to grupper. Oocyttene plasseres i 750 µl befruktningsmedium med maksimalt 5 oocytter. Etter inkubasjon ved 37°C insemineres oocyttene ved å tilsette 30 µl av sædprøven med enten lav eller høy konsentrasjon. Befruktning evalueres 18-20 timer etter insemineringen. Embryokvalitet vurderes på dag 2, 3 og 5 (spaltningsstadium, morfologi og symmetri). Avhengig av antall befruktede oocytter og antall tidligere sykluser, utføres embryooverføring på dag 2, 3 eller dag 5. I henhold til overføringspolitikken i den belgiske loven (Koninklijk Besluit, 1. juli 2003), overføres de beste embryoene (basert på spaltningsstadiet, morfologi og symmetri) inn i livmoren. På overføringsdagen blir alle overflødige embryoer av tilstrekkelig kvalitet kryokonservert.
• Utfallsvariabler og kraftberegning Den primære utfallsvariabelen for denne studien er embryoutviklingen evaluert ved antall embryoer av god kvalitet på dag 2 og dag 3 (i 7 eller 8 cellestadiet). For å teste hypotesen om at prosentandelen av 7 til 8 celleembryoer i gruppen med lav inseminasjonskonsentrasjon (150 000/ml spermatozoer) er signifikant høyere (40 %) enn prosentandelen av gruppen med høy inseminasjonskonsentrasjon (30 %). ), viste kraftberegning at det trengs 299 embryoer i hver gruppe på dag 3 (beta= 0,8 og alfa <0,05). Andre utfallsvariabler for denne studien er befruktningsraten, forekomsten av polyspermi, graviditetsrate og implantasjonshastighet per overført embryo.