Effet du nombre de spermatozoïdes inséminés sur le développement embryonnaire humain ultérieur in vitro

ARRIÈRE-PLAN

Dans les procédures de fécondation humaine in vitro, les ovocytes sont généralement inséminés avec des concentrations variant entre 50 000 et 150 000 spermatozoïdes par ml de milieu de fécondation. Il a été montré que l'augmentation de la concentration de spermatozoïdes à >200 000 par ml, entraîne une diminution des taux de fécondation (66,7% dans le groupe inséminé avec 200 000 spermatozoïdes/ml contre 79,7% dans le groupe inséminé avec 10 000- 90 000/ml ; p<0,001) (Mahadevan et Trounson, 1984). Ces résultats ont été confirmés par une autre étude (Diamond, Rogers et al., 1985). La raison de cette diminution du taux de fécondation n'est pas claire, mais on a émis l'hypothèse que la présence de concentrations élevées de produits du métabolisme ou de dégradation des spermatozoïdes associées à un plus grand nombre de spermatozoïdes pourrait nuire à la viabilité des spermatozoïdes et des ovocytes. Dumoulin et al. 1992 ont montré que l'augmentation de la concentration de spermatozoïdes affecte non seulement le taux de fécondation mais aussi le développement embryonnaire (Dumoulin, Bras et al., 1992). Significativement moins d'embryons à développement rapide (stades 4 cellules et 5 à 8 cellules) ont été trouvés au jour 2 dans le groupe 100 000/ml (53,4 %) que dans le groupe 50 000/ml (65,5 % ; p<0,05 ).

Au Leuven University Fertility Center (LUFC) les ovocytes sont traditionnellement inséminés depuis plus de 15 ans avec une concentration de spermatozoïdes plus élevée (600 000 spermatozoïdes/ml) que les concentrations moyennes publiées (50 000 à 200 000 spermatozoïdes mobiles/ml) (Chen et Kattera, 2006 ; Dumoulin, Bras et al., 1992 ; Racowsky, Combelles et al., 2003) Cette concentration plus élevée pour l'insémination pourrait être à l'origine du taux plus faible d'embryons à 8 cellules au jour 3 observé au LUFC lorsque par rapport à la littérature. Au LUFC, seuls 20 % des embryons atteignent le stade 8 cellules au jour 3. Dans la littérature, la proportion d'embryons à 8 cellules au jour 3 a été rapportée entre 30 et 37 % (Chen et Kattera, 2006 ; Racowsky, Combelles et al., 2003 ; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

Dans cet essai prospectif randomisé, nous testerons l'hypothèse selon laquelle le développement embryonnaire peut être amélioré en réduisant la concentration de spermatozoïdes lors de l'insémination. Il s'agira du premier essai randomisé montrant l'effet d'une insémination avec 600 000 spermatozoïdes/ml sur le développement embryonnaire au jour 3.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

• Patientes Toutes les patientes ayant au moins quatre ovocytes seront incluses dans cette étude. De plus, pour être inclus dans l'étude, l'échantillon de sperme le jour du prélèvement doit avoir un nombre total de motilités après traitement d'au moins 10 x 106/ml. Tous les patients ICSI seront exclus de cette étude.
• Randomisation Pour chaque patiente, tous les ovocytes seront assignés au hasard à la faible concentration d'insémination (150 000/ml) ou à la forte concentration (600 000/ml). La randomisation se fera au moment du prélèvement des ovocytes selon le principe « un ici - un là ».
• Résultats de l'étude pilote Avant de commencer cet essai prospectif randomisé, nous avons mené une étude pilote pour vérifier si le taux de fécondation n'était pas influencé par la réduction de la concentration d'insémination. 268 ovocytes de 21 patientes ont été inclus dans cette étude pilote. Seuls les patients avec un bon pronostic (défini comme un taux de fécondation d'au moins 70 % dans le cycle précédent et de bons paramètres spermatiques : au moins 10 x 106 spermatozoïdes mobiles par ml après traitement et un minimum de 60 % de spermatozoïdes mobiles) ont été sélectionnés. Au début, la concentration d'insémination était réduite de moitié. Le taux de fécondation n'a pas changé de manière significative lorsque nous avons inséminé avec 300 000 spermatozoïdes par ml au lieu de 600 000 par ml (75, 9 % contre 68,7 % ; p<0,05). Dans la seconde partie de l'étude pilote, la concentration a été abaissée à 150 000/ml. Il n'y a pas eu de diminution du taux de fécondation avec la diminution du nombre de spermatozoïdes (76,6% dans le groupe 150 000 versus 83,6% dans le groupe 600 000 ; p<0,05). Au jour 2, une augmentation de 10 % du nombre d'embryons de bonne qualité a été constatée (53,1 % d'embryons à 4 cellules dans le groupe 150 000 contre 42,6 % dans le groupe 600 000 ; p<0,05). Mais au jour 3 aucune différence dans le nombre d'embryons de bonne qualité n'a été observée dans ce petit groupe (32,7% dans le groupe 150 000 versus 36,1% dans le groupe 600 000 ; p<0,05). Cette étude pilote a montré que la diminution de la concentration de spermatozoïdes pour l'insémination ne réduit pas le taux de fécondation et peut avoir un effet bénéfique sur le développement de l'embryon, mais davantage de patients doivent être étudiés pour confirmer cette tendance.
• Préparation du sperme Les échantillons de sperme sont préparés à l'aide d'une technique de centrifugation en gradient de densité. Les échantillons sont déposés sur un gradient Isolate et centrifugés à 1450 rpm pendant 20 minutes. Le culot obtenu est lavé deux fois par centrifugation. Ensuite, le culot est remis en suspension dans 0,75 ml de milieu de fertilisation. Après comptage, l'échantillon est dilué à une concentration finale de 10 x 106 spermatozoïdes mobiles par ml (c'est la concentration utilisée pour le groupe à forte insémination). Pour le groupe à faible insémination, l'échantillon de sperme sera à nouveau dilué à une concentration de 2,5 x 106 spermatozoïdes mobiles par ml.
• Culture et transfert d'embryons Au cours de l'aspiration des ovocytes, les ovocytes seront divisés en deux groupes. Les ovocytes sont placés dans 750 µl de milieu de fécondation avec un maximum de 5 ovocytes. Après incubation à 37°C, les ovocytes sont inséminés en ajoutant 30 µl de l'échantillon de sperme avec la concentration basse ou haute. La fécondation est évaluée 18-20h après l'insémination. La qualité des embryons est évaluée aux jours 2, 3 et 5 (stade de clivage, morphologie et symétrie). En fonction du nombre d'ovocytes fécondés et du nombre de cycles précédents, le transfert d'embryons est réalisé à J2, J3 ou J5. Selon la politique de transfert de la loi belge (Koninklijk Besluit, 1er juillet 2003), le ou les meilleurs embryons (basés sur le stade de clivage, la morphologie et la symétrie) sont transférés dans l'utérus. Le jour du transfert, tous les embryons excédentaires de qualité suffisante sont cryoconservés.
• Variables de résultat et calcul de la puissance La principale variable de résultat de cette étude est le développement embryonnaire évalué par le nombre d'embryons de bonne qualité aux jours 2 et 3 (au stade 7 ou 8 cellules). Tester l'hypothèse que le pourcentage de 7 à 8 cellules-embryons dans le groupe à faible concentration d'insémination (150 000 spermatozoïdes/ml) est significativement plus élevé (40%) que le pourcentage du groupe à forte concentration d'insémination (30% ), le calcul de puissance a révélé que 299 embryons sont nécessaires dans chaque groupe au jour 3 (bêta = 0,8 et alpha <0,05). D'autres variables de résultat de cette étude sont le taux de fécondation, l'incidence de la polyspermie, le taux de grossesse et le taux d'implantation par embryon transféré.