Effetto del numero di spermatozoi inseminati sul successivo sviluppo embrionale umano in vitro

SFONDO

Nelle procedure di fecondazione umana in vitro, gli ovociti vengono solitamente inseminati con concentrazioni che variano tra 50.000 e 150.000 spermatozoi per ml di mezzo di fecondazione. È stato dimostrato che l'aumento della concentrazione di spermatozoi a >200.000 per ml si traduce in tassi di fecondazione ridotti (66,7% nel gruppo inseminato con 200.000 spermatozoi/ml contro 79,7% nel gruppo inseminato con 10.000- 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan e Trounson, 1984). Questi risultati sono stati confermati da un altro studio (Diamond, Rogers et al., 1985). La ragione di questa diminuzione del tasso di fecondazione non è chiara, ma è stato ipotizzato che la presenza di alte concentrazioni di metabolismo dello sperma o di prodotti di degradazione associati a un numero maggiore di spermatozoi possa influire negativamente sulla vitalità dello sperma e degli ovociti. Dumulin et al. 1992 ha dimostrato che l'aumento della concentrazione di spermatozoi influisce non solo sul tasso di fecondazione ma anche sullo sviluppo dell'embrione (Dumoulin, Bras et al., 1992). Al giorno 2 è stato trovato un numero significativamente inferiore di embrioni a sviluppo rapido (stadi a 4 cellule e da 5 a 8 cellule) nel gruppo 100.000/ml (53,4%) rispetto al gruppo 50.000/ml (65,5%; p<0,05 ).

Presso il Leuven University Fertility Center (LUFC) gli ovociti sono stati inseminati tradizionalmente per più di 15 anni con una concentrazione di spermatozoi superiore (600.000/ml spermatozoi) rispetto alle concentrazioni medie pubblicate (da 50.000 a 200.000 spermatozoi mobili/ml) (Chen e Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003). rispetto alla letteratura. Al LUFC solo il 20% degli embrioni raggiunge lo stadio di 8 cellule il giorno 3. In letteratura la percentuale di embrioni di 8 cellule al giorno 3 è stata riportata tra il 30 e il 37% (Chen e Kattera, 2006;Racowsky, Combelles et al., 2003;Racowsky, Orasanu et al., 2005).

In questo studio prospettico randomizzato verificheremo l'ipotesi che lo sviluppo dell'embrione possa essere migliorato riducendo la concentrazione di spermatozoi durante l'inseminazione. Questo sarà il primo studio randomizzato che mostra l'effetto dell'inseminazione con 600.000 spermatozoi/ml sullo sviluppo dell'embrione il giorno 3.

MATERIALI E METODI

• Pazienti Tutti i pazienti con almeno quattro ovociti saranno inclusi in questo studio. Inoltre, per essere incluso nello studio, il campione di seme al giorno del prelievo deve avere un conteggio totale della motilità dopo l'elaborazione di almeno 10 x 106/ml. Tutti i pazienti ICSI saranno esclusi da questo studio.
• Randomizzazione Per ogni paziente, tutti gli ovociti saranno assegnati in modo casuale alla bassa concentrazione di inseminazione (150.000/ml) o all'alta concentrazione (600.000/ml). La randomizzazione verrà effettuata al momento del prelievo degli ovociti secondo il principio "uno qui - uno là".
• Risultati dello studio pilota Prima di iniziare questo studio prospettico randomizzato, abbiamo condotto uno studio pilota per verificare se il tasso di fecondazione non fosse influenzato dalla riduzione della concentrazione di inseminazione. In questo studio pilota sono stati inclusi 268 ovociti di 21 pazienti. Sono stati selezionati solo i pazienti con una buona prognosi (definita come tasso di fecondazione di almeno il 70% nel ciclo precedente e buoni parametri spermatici: almeno 10 x 106 spermatozoi mobili per ml dopo la processazione e minimo 60% di spermatozoi mobili). Inizialmente, la concentrazione di inseminazione è stata dimezzata. Il tasso di fecondazione non è cambiato significativamente quando abbiamo inseminato con 300.000 spermatozoi per ml invece che con 600.000 per ml (75,9% contro 68,7%; p<0,05). Nella seconda parte dello studio pilota la concentrazione è stata abbassata a 150 000/ml. Non vi è stata alcuna diminuzione del tasso di fecondazione con il numero ridotto di spermatozoi (76,6% nel gruppo 150.000 contro 83,6% nel gruppo 600.000; p<0,05). Il giorno 2 è stato notato un aumento del 10% nel numero di embrioni di buona qualità (53,1% di embrioni a 4 cellule nel gruppo 150.000 contro 42,6% nel gruppo 600.000; p<0,05). Ma il giorno 3 non è stata osservata alcuna differenza nel numero di embrioni di buona qualità in questo piccolo gruppo (32,7% nel gruppo 150.000 contro 36,1% nel gruppo 600.000; p<0,05). Questo studio pilota ha dimostrato che l'abbassamento della concentrazione di spermatozoi per l'inseminazione non riduce il tasso di fecondazione e può avere un effetto benefico sullo sviluppo dell'embrione, ma è necessario studiare più pazienti per confermare questa tendenza
• Preparazione dello sperma I campioni di sperma vengono preparati utilizzando una tecnica di centrifugazione in gradiente di densità. I campioni vengono caricati su un gradiente di isolamento e centrifugati a 1450 rpm per 20 minuti. Il pellet risultante viene lavato due volte mediante centrifugazione. Successivamente, il pellet viene risospeso in 0,75 ml di mezzo di fertilizzazione. Dopo il conteggio, il campione viene diluito ad una concentrazione finale di 10 x 106 spermatozoi mobili per ml (questa è la concentrazione utilizzata per il gruppo ad alta inseminazione). Per il gruppo a bassa inseminazione il campione di sperma sarà nuovamente diluito ad una concentrazione di 2,5 x 106 spermatozoi mobili per ml.
• Coltura e trasferimento dell'embrione Durante l'aspirazione degli ovociti gli ovociti saranno divisi in due gruppi. Gli ovociti vengono posti in un mezzo di fecondazione da 750 µl con un massimo di 5 ovociti. Dopo l'incubazione a 37°C, gli ovociti vengono inseminati aggiungendo 30 µl del campione di sperma con la concentrazione bassa o alta. La fecondazione viene valutata 18-20 ore dopo l'inseminazione. La qualità dell'embrione viene valutata il giorno 2, 3 e 5 (fase di scissione, morfologia e simmetria). A seconda del numero di ovociti fecondati e del numero di cicli precedenti, il trasferimento dell'embrione viene eseguito il giorno 2, 3 o 5. Secondo la politica di trasferimento della legge belga (Koninklijk Besluit, 1 juli 2003), gli embrioni migliori (in base allo stadio di scissione, morfologia e simmetria) vengono trasferiti nell'utero. Il giorno del trasferimento tutti gli embrioni in eccesso di qualità sufficiente vengono criopreservati.
• Variabili di risultato e calcolo della potenza La variabile di risultato principale di questo studio è lo sviluppo dell'embrione valutato dal numero di embrioni di buona qualità il giorno 2 e il giorno 3 (in 7 o 8 cellule). Per verificare l'ipotesi che la percentuale di embrioni da 7 a 8 cellule nel gruppo con la bassa concentrazione di inseminazione (150.000/ml di spermatozoi) sia significativamente più alta (40%) rispetto alla percentuale del gruppo con l'alta concentrazione di inseminazione (30% ), il calcolo della potenza ha rivelato che sono necessari 299 embrioni in ciascun gruppo il giorno 3 (beta= 0,8 e alfa <0,05). Altre variabili di esito di questo studio sono il tasso di fecondazione, l'incidenza della polispermia, il tasso di gravidanza e il tasso di impianto per embrione trasferito.