Vliv počtu inseminovaných spermií na následný lidský embryonální vývoj in vitro

POZADÍ

Při lidských postupech oplodnění in vitro se oocyty obvykle inseminují v koncentracích, které se pohybují mezi 50 000 a 150 000 spermií na ml oplodňovacího média. Bylo prokázáno, že zvýšení koncentrace spermií na > 200 000 na ml vede ke snížení míry oplodnění (66,7 % ve skupině inseminovaných 200 000 spermií/ml oproti 79,7 % ve skupině inseminovaných 10 000- 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan a Trounson, 1984). Tyto výsledky byly potvrzeny další studií (Diamond, Rogers et al., 1985). Důvod této snížené míry oplodnění není jasný, ale spekulovalo se, že přítomnost vysokých koncentrací metabolismu spermií nebo produktů degradace spojených s větším počtem spermií může nepříznivě ovlivnit životaschopnost spermií a oocytů. Dumoulin a kol. 1992 ukázal, že zvýšení koncentrace spermií ovlivňuje nejen rychlost oplodnění, ale také vývoj embrya (Dumoulin, Bras et al., 1992). Významně méně rychle se vyvíjejících embryí (4- a 5- až 8-buněčná stádia) bylo nalezeno 2. den ve skupině 100 000/ml (53,4 %) než ve skupině 50 000/ml (65,5 %; p<0,05 ).

V Leuven University Fertility Center (LUFC) jsou oocyty tradičně inseminovány již více než 15 let s vyšší koncentrací spermií (600 000/ml spermií), než jsou průměrné publikované koncentrace (50 000 až 200 000 pohyblivých spermií/ml) (Chen a Kattera, 2006; Dumoulin, Bras a kol., 1992; Racowsky, Combelles a kol., 2003) Tato vyšší koncentrace pro inseminaci může být příčinou nižšího počtu 8-buněčných embryí v den 3 pozorovaných v LUFC, když ve srovnání s literaturou. V LUFC pouze 20 % embryí dosáhne 8-buněčného stadia v den 3. V literatuře se uvádí, že podíl 8 buněčných embryí v den 3 je mezi 30 a 37 % (Chen a Kattera, 2006; Racowsky, Combelles a kol., 2003; Racowsky, Orasanu a kol., 2005).

V této prospektivní randomizované studii budeme testovat hypotézu, že vývoj embrya lze zlepšit snížením koncentrace spermií při inseminaci. Půjde o první randomizovanou studii ukazující účinek inseminace 600 000 spermií/ml na vývoj embrya v den 3.

MATERIÁLY A METODY

• Pacienti Do této studie budou zahrnuti všichni pacienti s alespoň čtyřmi oocyty. Kromě toho pro zařazení do studie musí mít vzorek spermatu v den odběru celkovou pohyblivost po zpracování alespoň 10 x 106/ml. Všichni pacienti s ICSI budou z této studie vyloučeni.
• Randomizace U každé pacientky budou všechny oocyty náhodně přiřazeny k nízké inseminační koncentraci (150 000/ml) nebo vysoké koncentraci (600 000/ml). Randomizace bude provedena v době odběru oocytů podle principu „jeden sem – jeden tam“.
• Výsledky pilotní studie Před zahájením této prospektivní randomizované studie jsme provedli pilotní studii, abychom ověřili, zda míra oplodnění nebyla ovlivněna snížením koncentrace inseminace. Do této pilotní studie bylo zahrnuto 268 oocytů 21 pacientek. Byli vybráni pouze pacienti s dobrou prognózou (definovanou jako míra oplodnění alespoň 70 % v předchozím cyklu a dobré parametry spermií: alespoň 10 x 106 pohyblivých spermií na ml po zpracování a minimálně 60 % pohyblivých spermií). Nejprve byla koncentrace inseminace snížena na polovinu. Míra oplodnění se významně nezměnila, když jsme inseminovali 300 000 spermií na ml namísto 600 000 na ml (75, 9 % versus 68,7 %; p < 0,05). Ve druhé části pilotní studie byla koncentrace snížena na 150 000/ml. Při sníženém počtu spermií nedošlo k poklesu míry oplodnění (76,6 % ve skupině 150 000 oproti 83,6 % ve skupině 600 000; p<0,05). V den 2 byl zaznamenán 10procentní nárůst počtu embryí dobré kvality (53,1 % 4buněčných embryí ve skupině 150 000 versus 42,6 % ve skupině 600 000; p<0,05). Ale 3. den nebyl v této malé skupině pozorován žádný rozdíl v počtu embryí dobré kvality (32,7 % ve skupině 150 000 versus 36,1 % ve skupině 600 000; p<0,05). Tato pilotní studie ukázala, že snížení koncentrace spermií pro inseminaci nesnižuje míru oplodnění a může mít příznivý vliv na vývoj embrya, ale k potvrzení tohoto trendu je třeba studovat více pacientů.
• Příprava spermií Vzorky spermií se připravují pomocí centrifugační techniky s hustotním gradientem. Vzorky se nanesou na gradient Isolate a odstřeďují se při 1450 otáčkách za minutu po dobu 20 minut. Výsledná peleta se dvakrát promyje centrifugací. Poté se peleta resuspenduje v 0,75 ml hnojiva. Po sčítání se vzorek zředí na konečnou koncentraci 10 x 106 pohyblivých spermií na ml (toto je koncentrace používaná pro skupinu s vysokou inseminací). U skupiny s nízkou inseminací bude vzorek spermatu znovu naředěn na koncentraci 2,5 x 106 pohyblivých spermií na ml.
• Kultivace a přenos embrya Během aspirace oocytů budou oocyty rozděleny do dvou skupin. Oocyty se umístí do 750 ul oplodňovacího média s maximálně 5 oocyty. Po inkubaci při 37 °C se oocyty inseminují přidáním 30 ul vzorku spermatu s nízkou nebo vysokou koncentrací. Oplodnění se hodnotí 18-20 hodin po inseminaci. Kvalita embrya se hodnotí 2., 3. a 5. den (stupeň štěpení, morfologie a symetrie). V závislosti na počtu oplodněných oocytů a na počtu předchozích cyklů se embryotransfer provádí 2., 3. nebo 5. den. Podle přenosové politiky belgického zákona (Koninklijk Besluit, 1. července 2003) jsou nejlepší embryo (na základě stádia štěpení, morfologie a symetrie) přenesena do dělohy. V den transferu jsou všechna přebytečná embrya dostatečné kvality kryokonzervována.
• Výstupní proměnné a výpočet síly Primární výstupní proměnnou této studie je vývoj embrya hodnocený počtem embryí dobré kvality v den 2 a den 3 (ve 7 nebo 8 buněčném stadiu). Testovat hypotézu, že procento 7 až 8 buněčných embryí ve skupině s nízkou koncentrací inseminace (150 000/ml spermií) je významně vyšší (40 %) než procento ve skupině s vysokou koncentrací inseminace (30 %) ), výpočet síly ukázal, že 299 embryí je potřeba v každé skupině v den 3 (beta= 0,8 a alfa <0,05). Dalšími výstupními proměnnými této studie jsou míra oplodnění, výskyt polyspermie, míra těhotenství a míra implantace na přenesené embryo.