Wpływ liczby inseminowanych plemników na późniejszy rozwój embrionalny człowieka in vitro

TŁO

W procedurach zapłodnienia in vitro u ludzi oocyty są zwykle inseminowane w stężeniach wahających się od 50 000 do 150 000 plemników na ml pożywki do zapłodnienia. Wykazano, że zwiększenie stężenia plemników do >200 000 na ml skutkuje zmniejszeniem współczynnika zapłodnienia (66,7% w grupie inseminowanej 200 000 plemników/ml w porównaniu do 79,7% w grupie inseminowanej 10 000 plemników/ml). 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan i Trounson, 1984). Wyniki te zostały potwierdzone w innym badaniu (Diamond, Rogers i in., 1985). Przyczyna tego zmniejszonego wskaźnika zapłodnienia jest niejasna, ale spekulowano, że obecność wysokich stężeń metabolizmu plemników lub produktów degradacji związanych z większą liczbą plemników może niekorzystnie wpływać na żywotność plemników i oocytów. Dumoulin i in. 1992 wykazali, że zwiększenie stężenia plemników wpływa nie tylko na tempo zapłodnienia, ale także na rozwój zarodka (Dumoulin, Bras i in., 1992). Znacznie mniej szybko rozwijających się zarodków (stadia 4-komórkowe i 5-8-komórkowe) stwierdzono w 2. dniu w grupie 100 000/ml (53,4%) niż w grupie 50 000/ml (65,5%; p<0,05) ).

W Leuven University Fertility Center (LUFC) oocyty są inseminowane tradycyjnie od ponad 15 lat przy wyższym stężeniu plemników (600 000/ml plemników) niż średnie opublikowane stężenia (50 000 do 200 000 ruchliwych plemników/ml) (Chen i Kattera, 2006; Dumoulin, Bras i in., 1992; Racowsky, Combelles i in., 2003) To wyższe stężenie do inseminacji może być przyczyną niższego wskaźnika zarodków 8-komórkowych w 3. w porównaniu z literaturą. W LUFC tylko 20% zarodków osiąga stadium 8-komórkowe w dniu 3. W literaturze odsetek 8 zarodków komórkowych w dniu 3 wynosi od 30 do 37% (Chen i Kattera, 2006; Racowsky, Combelles i in., 2003; Racowsky, Orasanu i in., 2005).

W tym prospektywnym, randomizowanym badaniu przetestujemy hipotezę, że rozwój zarodka można poprawić poprzez zmniejszenie stężenia plemników podczas inseminacji. Będzie to pierwsze randomizowane badanie pokazujące wpływ inseminacji 600 000 plemników/ml na rozwój zarodka w 3. dobie.

MATERIAŁY I METODY

• Pacjenci Wszyscy pacjenci z co najmniej czterema komórkami jajowymi zostaną włączeni do tego badania. Ponadto, aby włączyć do badania, próbka nasienia w dniu pobrania musi mieć całkowitą ruchliwość po przetworzeniu co najmniej 10 x 106 /ml. Wszyscy pacjenci z ICSI zostaną wykluczeni z tego badania.
• Randomizacja Dla każdego pacjenta wszystkie komórki jajowe zostaną losowo przypisane do niskiego stężenia inseminacyjnego (150 000/ml) lub wysokiego stężenia (600 000/ml). Randomizacja zostanie przeprowadzona w momencie pobrania komórek jajowych zgodnie z zasadą „jeden tu – jeden tam”.
• Wyniki badania pilotażowego Przed rozpoczęciem tego prospektywnego badania z randomizacją przeprowadziliśmy badanie pilotażowe, aby sprawdzić, czy na wskaźnik zapłodnień nie wpłynęło zmniejszenie stężenia inseminacji. Do tego pilotażowego badania włączono 268 oocytów 21 pacjentów. Wybrano tylko pacjentki z dobrym rokowaniem (określanym jako współczynnik zapłodnienia co najmniej 70% w poprzednim cyklu i dobre parametry plemników: co najmniej 10 x 106 ruchliwych plemników w ml po obróbce i co najmniej 60% ruchliwych plemników). Początkowo stężenie inseminacji zostało zmniejszone o połowę. Wskaźnik zapłodnienia nie zmienił się znacząco, gdy inseminowaliśmy 300 000 plemników na ml zamiast 600 000 na ml (75,9% vs 68,7%; p<0,05). W drugiej części badania pilotażowego stężenie zostało obniżone do 150 000/ml. Nie obserwowano spadku współczynnika zapłodnienia przy zmniejszonej liczbie plemników (76,6% w grupie 150 000 vs 83,6% w grupie 600 000; p<0,05). W 2. dobie odnotowano 10-procentowy wzrost liczby zarodków dobrej jakości (53,1% zarodków 4-komórkowych w grupie 150 000 wobec 42,6% w grupie 600 000; p<0,05). Jednak w 3. dobie nie zaobserwowano różnicy w liczbie zarodków dobrej jakości w tej małej grupie (32,7% w grupie 150 000 vs 36,1% w grupie 600 000; p<0,05). To badanie pilotażowe wykazało, że obniżenie stężenia plemników do inseminacji nie zmniejsza wskaźnika zapłodnienia i może mieć korzystny wpływ na rozwój zarodka, ale należy zbadać więcej pacjentów, aby potwierdzić ten trend
• Przygotowanie nasienia Próbki nasienia są przygotowywane przy użyciu techniki wirowania w gradiencie gęstości. Próbki umieszcza się na gradiencie Isolate i wiruje przy 1450 obr./min przez 20 minut. Otrzymany osad przemywa się dwukrotnie przez wirowanie. Następnie osad ponownie zawiesza się w 0,75 ml pożywki nawozowej. Po zliczeniu próbkę rozcieńcza się do końcowego stężenia 10 x 106 ruchliwych plemników na ml (jest to stężenie stosowane dla grupy o wysokiej inseminacji). W przypadku grupy o niskiej inseminacji próbka nasienia zostanie ponownie rozcieńczona do stężenia 2,5 x 106 ruchliwych plemników na ml.
• Hodowla i transfer zarodków Podczas aspiracji oocytów zostaną one podzielone na dwie grupy. Oocyty umieszcza się w 750 µl pożywki do nawożenia z maksymalnie 5 oocytami. Po inkubacji w temperaturze 37°C oocyty inseminuje się przez dodanie 30 µl próbki plemników o niskim lub wysokim stężeniu. Zapłodnienie ocenia się 18-20h po inseminacji. Jakość zarodka oceniana jest w 2, 3 i 5 dniu (stadium rozszczepienia, morfologia i symetria). W zależności od liczby zapłodnionych komórek jajowych oraz liczby poprzednich cykli transfer zarodków przeprowadzany jest w 2, 3 lub 5 dniu. Zgodnie z polityką transferu zawartą w prawie belgijskim (Koninklijk Besluit, 1 lipca 2003), najlepsze zarodki (w oparciu o stadium rozszczepienia, morfologię i symetrię) są przenoszone do macicy. W dniu transferu wszystkie nadwyżkowe zarodki o odpowiedniej jakości są poddawane kriokonserwacji.
• Zmienne wyniku i obliczenia mocy Podstawową zmienną wyniku tego badania jest rozwój zarodka oceniany na podstawie liczby zarodków dobrej jakości w dniu 2 i 3 (w stadium 7 lub 8 komórek). Aby przetestować hipotezę, że odsetek 7-8 zarodków komórkowych w grupie o niskim stężeniu inseminacji (150 000/ml plemników) jest istotnie wyższy (40%) niż odsetek grupy o wysokim stężeniu inseminacji (30% ), obliczenie mocy wykazało, że w każdej grupie potrzeba 299 zarodków w dniu 3 (beta = 0,8 i alfa <0,05). Inne zmienne wynikowe tego badania to wskaźnik zapłodnienia, częstość występowania polispermii, wskaźnik ciąż i wskaźnik implantacji na przeniesiony zarodek.