Effect van het aantal geïnsemineerde spermatozoa op de daaropvolgende menselijke embryonale ontwikkeling in vitro

ACHTERGROND

Bij menselijke in-vitrofertilisatieprocedures worden oöcyten gewoonlijk geïnsemineerd met concentraties die variëren tussen 50.000 en 150.000 spermatozoa per ml bevruchtingsmedium. Het is aangetoond dat het verhogen van de concentratie van spermatozoa tot >200 000 per ml resulteert in verminderde bevruchtingspercentages (66,7% in de groep geïnsemineerd met 200 000 spermatozoa/ml versus 79,7% in de groep geïnsemineerd met 10 000 spermatozoa/ml). 90.000/ml; p<0,001) (Mahadevan en Trounson, 1984). Deze resultaten werden bevestigd door een andere studie (Diamond, Rogers et al., 1985). De reden voor deze verminderde bevruchtingssnelheid is onduidelijk, maar er wordt gespeculeerd dat de aanwezigheid van hoge concentraties spermametabolisme of afbraakproducten geassocieerd met grotere aantallen spermatozoa de levensvatbaarheid van sperma en oöcyten nadelig kan beïnvloeden. Dumoulin et al. 1992 toonde aan dat het verhogen van de spermaconcentratie niet alleen de bevruchtingsgraad maar ook de embryo-ontwikkeling beïnvloedt (Dumoulin, Bras et al., 1992). Op dag 2 werden significant minder snel ontwikkelende embryo's (4-cellige en 5- tot 8-cellige stadia) gevonden in de groep van 100.000/ml (53,4%) dan in de groep van 50.000/ml (65,5%; p<0,05 ).

In het Leuvens Universitair Fertiliteitscentrum (LUFC) worden eicellen al meer dan 15 jaar traditioneel geïnsemineerd met een hogere spermaconcentratie (600 000/ml spermatozoa) dan de gemiddelde gepubliceerde concentraties (50 000 tot 200 000 beweeglijke spermacellen/ml) (Chen en Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Deze hogere concentratie voor de inseminatie kan de oorzaak zijn van het lagere aantal 8-cellige embryo's op dag 3 waargenomen in het LUFC wanneer vergeleken met de literatuur. Bij het LUFC bereikt slechts 20% van de embryo's op dag 3 het 8-cellige stadium. In de literatuur wordt gerapporteerd dat het aandeel van 8-cellige embryo's op dag 3 tussen de 30 en 37% ligt (Chen en Kattera, 2006;Racowsky, Combelles et al., 2003;Racowsky, Orasanu et al., 2005).

In deze prospectieve gerandomiseerde studie zullen we de hypothese testen dat de embryo-ontwikkeling kan worden verbeterd door de spermaconcentratie bij inseminatie te verminderen. Dit wordt de eerste gerandomiseerde studie die het effect laat zien van inseminatie met 600.000 zaadcellen/ml op de embryo-ontwikkeling op dag 3.

MATERIALEN EN METHODES

• Patiënten Alle patiënten met ten minste vier eicellen zullen in deze studie worden opgenomen. Bovendien moet het spermamonster voor opname in het onderzoek op de dag van pick-up een totale motiliteitstelling hebben van ten minste 10 x 106 /ml. Alle ICSI-patiënten zullen worden uitgesloten van deze studie.
• Randomisatie Voor elke patiënt worden alle eicellen willekeurig toegewezen aan de lage inseminatieconcentratie (150 000/ml) of de hoge concentratie (600 000/ml). De randomisatie gebeurt op het moment van de eicelpunctie volgens het principe "één hier - één daar".
• Resultaten pilotstudie Voor aanvang van deze prospectieve gerandomiseerde studie hebben wij een pilotstudie uitgevoerd om na te gaan of de bevruchtingsgraad niet werd beïnvloed door de verlaging van de inseminatieconcentratie. In deze pilootstudie werden 268 eicellen van 21 patiënten geïncludeerd. Alleen patiënten met een goede prognose (gedefinieerd als een bevruchtingspercentage van ten minste 70% in de vorige cyclus en goede spermaparameters: ten minste 10 x 106 beweeglijke spermatozoa per ml na verwerking en minimaal 60% beweeglijke spermatozoa) werden geselecteerd. In eerste instantie werd de inseminatieconcentratie gehalveerd. Het bevruchtingspercentage veranderde niet significant toen we insemineerden met 300 000 zaadcellen per ml in plaats van met 600 000 per ml (75, 9% versus 68,7%; p<0,05). In het tweede deel van de pilootstudie werd de concentratie verlaagd tot 150 000/ml. Er was geen afname van het bevruchtingspercentage met het verminderde aantal spermatozoa (76,6% in de groep van 150.000 versus 83,6% in de groep van 600.000; p<0,05). Op dag 2 werd een toename van 10 procent waargenomen in het aantal embryo's van goede kwaliteit (53,1% 4-cellige embryo's in de groep van 150.000 versus 42,6% in de groep van 600.000; p<0,05). Maar op dag 3 werd er geen verschil waargenomen in het aantal embryo's van goede kwaliteit in deze kleine groep (32,7% in de 150 000 groep versus 36,1% in de 600 000 groep; p<0,05). Deze pilootstudie toonde aan dat het verlagen van de spermaconcentratie voor inseminatie de bevruchtingssnelheid niet vermindert en een gunstig effect kan hebben op de ontwikkeling van het embryo, maar er moeten meer patiënten worden onderzocht om deze trend te bevestigen
• Spermabereiding Spermamonsters worden bereid met behulp van een dichtheidsgradiëntcentrifugatietechniek. De monsters worden op een isolaatgradiënt geladen en gedurende 20 minuten bij 1450 rpm gecentrifugeerd. De resulterende pellet wordt tweemaal gewassen door centrifugeren. Daarna wordt de pellet geresuspendeerd in 0,75 ml bemestingsmedium. Na telling wordt het monster verdund tot een eindconcentratie van 10 x 106 beweeglijke spermatozoa per ml (dit is de concentratie die wordt gebruikt voor de groep met hoge inseminatie). Voor de groep met lage inseminatie wordt het spermamonster opnieuw verdund tot een concentratie van 2,5 x 106 beweeglijke spermatozoa per ml.
• Embryokweek en transfer Tijdens de eicelaspiratie worden de eicellen in twee groepen verdeeld. De eicellen worden in 750 µl bemestingsmedium met een maximum van 5 eicellen geplaatst. Na incubatie bij 37°C worden oöcyten geïnsemineerd door toevoeging van 30 µl van het spermamonster met ofwel de lage ofwel de hoge concentratie. De bevruchting wordt 18-20 uur na de inseminatie geëvalueerd. De kwaliteit van het embryo wordt beoordeeld op dag 2, 3 en 5 (splitsingsstadium, morfologie en symmetrie). Afhankelijk van het aantal bevruchte eicellen en het aantal voorgaande cycli vindt de embryotransfer plaats op dag 2, 3 of dag 5. Volgens het terugplaatsingsbeleid van de Belgische wet (Koninklijk Besluit, 1 juli 2003) worden de beste embryo('s) (op basis van decolletéstadium, morfologie en symmetrie) teruggeplaatst in de baarmoeder. Op de dag van terugplaatsing worden alle overtollige embryo's van voldoende kwaliteit ingevroren.
• Uitkomstvariabelen en Power-berekening De primaire uitkomstvariabele van deze studie is de ontwikkeling van het embryo, geëvalueerd aan de hand van het aantal embryo's van goede kwaliteit op dag 2 en dag 3 (in 7- of 8-cellig stadium). Om de hypothese te testen dat het percentage van 7 tot 8 cel-embryo's in de groep met de lage inseminatieconcentratie (150 000/ml spermatozoa) significant hoger is (40%) dan het percentage van de groep met de hoge inseminatieconcentratie (30% ), bleek uit powerberekening dat er op dag 3 in elke groep 299 embryo's nodig zijn (bèta=0,8 en alfa <0,05). Andere uitkomstvariabelen van deze studie zijn het bevruchtingspercentage, de incidentie van polyspermie, het zwangerschapspercentage en het implantatiepercentage per teruggeplaatst embryo.