Влияние количества осемененных сперматозоидов на последующее эмбриональное развитие человека in vitro

ФОН

В процедурах экстракорпорального оплодотворения человека ооциты обычно осеменяют с концентрациями, которые варьируются от 50 000 до 150 000 сперматозоидов на мл среды для оплодотворения. Показано, что увеличение концентрации сперматозоидов до >200 000 сперматозоидов в мл приводит к снижению частоты оплодотворения (66,7% в группе, осемененной 200 000 сперматозоидов/мл, по сравнению с 79,7% в группе, осемененной 10 000 сперматозоидов/мл). 90 000/мл; p<0,001) (Mahadevan, Trounson, 1984). Эти результаты были подтверждены другим исследованием (Diamond, Rogers et al., 1985). Причина такого снижения скорости оплодотворения неясна, но предполагалось, что присутствие высоких концентраций продуктов метаболизма сперматозоидов или продуктов деградации, связанных с большим количеством сперматозоидов, может неблагоприятно влиять на жизнеспособность сперматозоидов и ооцитов. Дюмулен и др. 1992 г. показали, что увеличение концентрации сперматозоидов влияет не только на скорость оплодотворения, но и на развитие эмбриона (Dumoulin, Bras et al., 1992). На 2-й день в группе 100 000/мл было обнаружено значительно меньше быстроразвивающихся эмбрионов (стадии 4 и 5–8 клеток) (53,4%), чем в группе 50 000/мл (65,5%; p<0,05). ).

В Центре фертильности Лёвенского университета (LUFC) ооциты традиционно осеменяют уже более 15 лет с более высокой концентрацией сперматозоидов (600 000/мл сперматозоидов), чем средние опубликованные концентрации (от 50 000 до 200 000 подвижных сперматозоидов/мл) (Chen и Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Эта более высокая концентрация для осеменения может быть причиной более низкой доли 8-клеточных эмбрионов на 3-й день, наблюдаемой в LUFC, когда по сравнению с литературой. При LUFC только 20% эмбрионов достигают стадии 8 клеток на 3-й день. В литературе сообщается, что доля 8-клеточных эмбрионов на 3-й день составляет от 30 до 37% (Chen and Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

В этом проспективном рандомизированном исследовании мы проверим гипотезу о том, что развитие эмбриона можно улучшить за счет снижения концентрации сперматозоидов при осеменении. Это будет первое рандомизированное исследование, показывающее влияние инсеминации 600 000 сперматозоидов/мл на развитие эмбриона на 3-й день.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

• Пациенты. В это исследование будут включены все пациенты с не менее чем четырьмя ооцитами. Кроме того, для включения в исследование образец спермы в день забора должен иметь общее число подвижных элементов после обработки не менее 10 x 106/мл. Все пациенты с ИКСИ будут исключены из этого исследования.
• Рандомизация Для каждого пациента все ооциты будут случайным образом распределены по низкой концентрации осеменения (150 000/мл) или высокой концентрации (600 000/мл). Рандомизация будет проводиться во время забора ооцитов по принципу «одна здесь – одна там».
• Результаты пилотного исследования Перед началом этого проспективного рандомизированного исследования мы провели пилотное исследование, чтобы проверить, не повлияло ли на коэффициент оплодотворения снижение концентрации осеменения. В это пилотное исследование были включены 268 ооцитов 21 пациентки. Отбирали только пациентов с хорошим прогнозом (определяемым как уровень оплодотворения не менее 70 % в предыдущем цикле и хорошие параметры спермы: не менее 10 x 106 подвижных сперматозоидов на мл после обработки и не менее 60 % подвижных сперматозоидов). Сначала концентрацию осеменения уменьшили вдвое. Коэффициент оплодотворения существенно не изменился при осеменении 300 000 сперматозоидов на мл вместо 600 000 на мл (75,9% против 68,7%; p<0,05). Во второй части экспериментального исследования концентрация была снижена до 150 000/мл. Снижения частоты оплодотворения при уменьшении количества сперматозоидов не наблюдалось (76,6% в группе 150 000 против 83,6% в группе 600 000; p<0,05). На 2-й день отмечено 10-процентное увеличение количества эмбрионов хорошего качества (53,1% 4-клеточных эмбрионов в группе 150 000 против 42,6% в группе 600 000; p<0,05). Но на 3-й день разницы в количестве эмбрионов хорошего качества в этой небольшой группе не наблюдалось (32,7% в группе 150 000 против 36,1% в группе 600 000; p<0,05). Это пилотное исследование показало, что снижение концентрации сперматозоидов для инсеминации не снижает частоту оплодотворения и может оказывать благотворное влияние на развитие эмбриона, но для подтверждения этой тенденции необходимо изучить больше пациентов.
• Подготовка спермы Образцы спермы готовятся с использованием метода центрифугирования в градиенте плотности. Образцы помещают в градиент изолята и центрифугируют при 1450 об/мин в течение 20 минут. Полученный осадок дважды промывают центрифугированием. После этого осадок ресуспендируют в 0,75 мл среды для удобрения. После подсчета образец разбавляют до конечной концентрации 10 х 106 подвижных сперматозоидов на мл (это концентрация, используемая для группы с высокой степенью осеменения). Для группы с низким уровнем осеменения образец спермы будет снова разбавлен до концентрации 2,5 x 106 подвижных сперматозоидов на мл.
• Культивирование и перенос эмбрионов Во время аспирации ооциты делятся на две группы. Ооциты помещают в 750 мкл среды для оплодотворения с максимум 5 ооцитами. После инкубации при 37°С ооциты осеменяют добавлением 30 мкл образца спермы либо с низкой, либо с высокой концентрацией. Оплодотворение оценивают через 18-20 часов после осеменения. Качество эмбриона оценивают на 2, 3 и 5 день (стадия дробления, морфология и симметрия). В зависимости от количества оплодотворенных яйцеклеток и количества предыдущих циклов перенос эмбрионов осуществляется на 2, 3 или 5 день. В соответствии с политикой переноса бельгийского законодательства (Koninklijk Besluit, 1 июля 2003 г.) лучшие эмбрионы (на основе стадии дробления, морфологии и симметрии) переносятся в матку. В день переноса все излишки эмбрионов достаточного качества криоконсервируются.
• Переменные исхода и расчет мощности Первичным переменным исхода в этом исследовании является развитие эмбриона, оцениваемое по количеству эмбрионов хорошего качества на 2-й и 3-й день (на стадии 7 или 8 клеток). Проверить гипотезу о том, что процент 7-8 клеточных эмбрионов в группе с низкой концентрацией осеменения (150 000/мл сперматозоидов) значительно выше (40%), чем процент группы с высокой концентрацией осеменения (30% ), расчет мощности показал, что на 3-й день в каждой группе необходимо 299 эмбрионов (бета = 0,8 и альфа <0,05). Другими переменными исхода этого исследования являются частота оплодотворения, частота полиспермии, частота наступления беременности и частота имплантации на перенесенный эмбрион.