Einfluss der Anzahl befruchteter Spermatozoen auf die spätere menschliche Embryonalentwicklung in vitro

HINTERGRUND

Bei menschlichen In-vitro-Fertilisationsverfahren werden Eizellen üblicherweise mit Konzentrationen befruchtet, die zwischen 50.000 und 150.000 Spermien pro ml Befruchtungsmedium variieren. Es hat sich gezeigt, dass eine Erhöhung der Spermienkonzentration auf >200.000 pro ml zu verringerten Befruchtungsraten führt (66,7 % in der Gruppe, die mit 200.000 Spermien/ml besamt wurde, gegenüber 79,7 % in der Gruppe, die mit 10.000 besamt wurde). 90.000/ml; p<0,001) (Mahadevan und Trounson, 1984). Diese Ergebnisse wurden durch eine andere Studie bestätigt (Diamond, Rogers et al., 1985). Der Grund für diese verringerte Befruchtungsrate ist unklar, es wurde jedoch spekuliert, dass das Vorhandensein hoher Konzentrationen von Spermienstoffwechsel- oder Abbauprodukten, die mit einer größeren Anzahl von Spermien einhergehen, die Lebensfähigkeit von Spermien und Eizellen beeinträchtigen könnte. Dumoulin et al. 1992 zeigte, dass eine Erhöhung der Spermienkonzentration nicht nur die Befruchtungsrate, sondern auch die Embryonalentwicklung beeinflusst (Dumoulin, Bras et al., 1992). Am Tag 2 wurden in der 100.000/ml-Gruppe (53,4 %) deutlich weniger sich schnell entwickelnde Embryonen (4-Zellen- und 5- bis 8-Zellen-Stadien) gefunden als in der 50.000/ml-Gruppe (65,5 %; p<0,05). ).

Am Leuven University Fertility Centre (LUFC) werden Eizellen traditionell seit mehr als 15 Jahren mit einer höheren Spermienkonzentration (600.000/ml Spermien) als den veröffentlichten Durchschnittskonzentrationen (50.000 bis 200.000 bewegliche Spermien/ml) befruchtet (Chen und Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Diese höhere Konzentration für die Befruchtung könnte die Ursache für die geringere Rate an 8-Zell-Embryonen am Tag 3 sein, die am LUFC beobachtet wurde im Vergleich zur Literatur. Am LUFC erreichen nur 20 % der Embryonen am dritten Tag das 8-Zellen-Stadium. In der Literatur wurde berichtet, dass der Anteil von 8-Zellen-Embryonen am dritten Tag zwischen 30 und 37 % liegt (Chen und Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

In dieser prospektiven randomisierten Studie werden wir die Hypothese testen, dass die Embryonalentwicklung durch eine Verringerung der Spermienkonzentration bei der Befruchtung verbessert werden kann. Dies wird die erste randomisierte Studie sein, die die Wirkung einer Befruchtung mit 600.000 Spermien/ml auf die Embryonalentwicklung am dritten Tag zeigt.

MATERIALEN UND METHODEN

• Patienten Alle Patientinnen mit mindestens vier Eizellen werden in diese Studie einbezogen. Darüber hinaus muss die Samenprobe am Tag der Entnahme für die Aufnahme in die Studie eine Gesamtmotilitätszahl nach der Verarbeitung von mindestens 10 x 106/ml aufweisen. Alle ICSI-Patienten werden von dieser Studie ausgeschlossen.
• Randomisierung Für jede Patientin werden alle Eizellen nach dem Zufallsprinzip der niedrigen Befruchtungskonzentration (150.000/ml) oder der hohen Konzentration (600.000/ml) zugeordnet. Die Randomisierung erfolgt zum Zeitpunkt der Eizellentnahme nach dem Prinzip „Einer hier – einer da“.
• Ergebnisse der Pilotstudie Vor Beginn dieser prospektiven randomisierten Studie haben wir eine Pilotstudie durchgeführt, um zu prüfen, ob die Befruchtungsrate nicht durch die Reduzierung der Besamungskonzentration beeinflusst wird. In diese Pilotstudie wurden 268 Eizellen von 21 Patientinnen einbezogen. Es wurden nur Patienten mit einer guten Prognose (definiert als eine Befruchtungsrate von mindestens 70 % im vorherigen Zyklus und gute Spermienparameter: mindestens 10 x 106 bewegliche Spermien pro ml nach der Verarbeitung und mindestens 60 % bewegliche Spermien) ausgewählt. Zunächst wurde die Besamungskonzentration halbiert. Die Befruchtungsrate änderte sich nicht wesentlich, wenn wir mit 300.000 Spermien pro ml statt mit 600.000 pro ml befruchteten (75,9 % gegenüber 68,7 %; p<0,05). Im zweiten Teil der Pilotstudie wurde die Konzentration auf 150.000/ml gesenkt. Es gab keinen Rückgang der Befruchtungsrate mit der verringerten Anzahl an Spermien (76,6 % in der 150.000-Gruppe gegenüber 83,6 % in der 600.000-Gruppe; p<0,05). Am zweiten Tag wurde ein 10-prozentiger Anstieg der Anzahl qualitativ hochwertiger Embryonen festgestellt (53,1 % 4-Zellen-Embryonen in der 150.000-Gruppe gegenüber 42,6 % in der 600.000-Gruppe; p<0,05). Am dritten Tag wurde jedoch in dieser kleinen Gruppe kein Unterschied in der Anzahl qualitativ hochwertiger Embryonen beobachtet (32,7 % in der 150.000-Gruppe gegenüber 36,1 % in der 600.000-Gruppe; p<0,05). Diese Pilotstudie zeigte, dass eine Senkung der Spermienkonzentration zur Befruchtung die Befruchtungsrate nicht verringert und sich möglicherweise positiv auf die Embryonalentwicklung auswirkt. Es müssen jedoch mehr Patienten untersucht werden, um diesen Trend zu bestätigen
• Spermienvorbereitung Spermienproben werden mithilfe einer Dichtegradientenzentrifugationstechnik vorbereitet. Die Proben werden auf einen Isolate-Gradienten geladen und 20 Minuten lang bei 1450 U/min zentrifugiert. Das resultierende Pellet wird zweimal durch Zentrifugieren gewaschen. Anschließend wird das Pellet in 0,75 ml Düngemedium resuspendiert. Nach der Zählung wird die Probe auf eine Endkonzentration von 10 x 106 beweglichen Spermien pro ml verdünnt (dies ist die Konzentration, die für die Gruppe mit hoher Insemination verwendet wird). Für die Gruppe mit geringer Insemination wird die Spermienprobe erneut auf eine Konzentration von 2,5 x 106 beweglichen Spermien pro ml verdünnt.
• Embryonenkultur und -transfer Während der Eizellenaspiration werden die Eizellen in zwei Gruppen aufgeteilt. Die Eizellen werden in 750 µl Befruchtungsmedium mit maximal 5 Eizellen gegeben. Nach der Inkubation bei 37 °C werden die Eizellen durch Zugabe von 30 µl der Spermienprobe mit entweder der niedrigen oder der hohen Konzentration befruchtet. Die Befruchtung wird 18–20 Stunden nach der Befruchtung beurteilt. Die Embryonenqualität wird am 2., 3. und 5. Tag bewertet (Spaltungsstadium, Morphologie und Symmetrie). Abhängig von der Anzahl der befruchteten Eizellen und der Anzahl der vorherigen Zyklen wird der Embryotransfer am 2., 3. oder 5. Tag durchgeführt. Gemäß der Transferpolitik des belgischen Gesetzes (Koninklijk Besluit, 1. Juli 2003) werden die besten Embryonen (basierend auf Spaltungsstadium, Morphologie und Symmetrie) in die Gebärmutter übertragen. Am Tag des Transfers werden alle überzähligen Embryonen in ausreichender Qualität kryokonserviert.
• Ergebnisvariablen und Leistungsberechnung Die primäre Ergebnisvariable dieser Studie ist die Embryonenentwicklung, bewertet anhand der Anzahl qualitativ hochwertiger Embryonen am 2. und 3. Tag (im 7- oder 8-Zellen-Stadium). Um die Hypothese zu testen, dass der Prozentsatz von 7 bis 8 Zellembryonen in der Gruppe mit der niedrigen Befruchtungskonzentration (150.000/ml Spermatozoen) deutlich höher ist (40 %), als der Prozentsatz der Gruppe mit der hohen Befruchtungskonzentration (30 %). ) ergab die Leistungsberechnung, dass am dritten Tag in jeder Gruppe 299 Embryonen benötigt werden (Beta = 0,8 und Alpha <0,05). Weitere Ergebnisvariablen dieser Studie sind die Befruchtungsrate, die Inzidenz von Polyspermie, die Schwangerschaftsrate und die Implantationsrate pro übertragenem Embryo.