受精した精子の数がその後の体外ヒト胚の発育に及ぼす影響

バックグラウンド

ヒトの体外受精手順では、通常、受精培地 1 ml あたり 50,000 ～ 150,000 個の精子の濃度で卵母細胞に授精されます。 精子濃度が 1 ml あたり 200,000 個を超えるまで増加すると、受精率が低下することが示されています (200,000 個の精子/ml で授精したグループでは 66.7%、10,000 個の精子で授精したグループでは 79,7%) 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan および Trounson、1984)。 これらの結果は別の研究によって確認されました (Diamond、Rogers et al.、1985)。 この受精率の低下の理由は明らかではありませんが、より多くの精子に関連する高濃度の精子代謝または分解産物の存在が、精子および卵母細胞の生存率に悪影響を与える可能性があると推測されています。 デュムランら。 1992 年は、精子濃度の増加が受精率だけでなく胚の発育にも影響を与えることを示しました (Dumoulin, Bras et al., 1992)。 2日目に認められた急速発育胚（4細胞期および5〜8細胞期）は、50,000/mlグループ（65.5％）よりも100,000/mlグループ（53.4％）で認められました。p<0.05 ）。

ルーヴェン大学不妊センター (LUFC) では、公表されている平均濃度 (50,000 ～ 200,000 運動精子/ml) よりも高い精子濃度 (精子 1ml あたり 600,000 個) で卵母細胞に 15 年以上伝統的に授精が行われています (Chen 氏) Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) この高い濃度の授精が、LUFC で観察される 3 日目の 8 細胞胚の発生率が低い原因である可能性があります。文学と比べて。 LUFC では、3 日目に 8 細胞期に達する胚はわずか 20% です。 文献では、3 日目の 8 細胞胚の割合は 30 ～ 37% であると報告されています (Chen and Kattera, 2006;Racowsky, Combelles et al., 2003;Racowsky, Orasanu et al., 2005)。

この前向きランダム化試験では、授精時の精子濃度を下げることで胚の発育を改善できるという仮説を検証します。 これは、3日目の胚の発育に対する60万精子/mlの授精の影響を示す最初のランダム化試験となる。

材料および方法

• 患者 少なくとも 4 個の卵母細胞を持つすべての患者がこの研究に含まれます。 さらに、研究に含めるには、採取日の精液サンプルの処理後の総運動性カウントが少なくとも 10 x 106 /ml である必要があります。 すべてのICSI患者はこの研究から除外されます。
• ランダム化 各患者について、すべての卵子が低濃度の授精濃度 (150,000/ml) または高濃度 (600,000/ml) にランダムに割り当てられます。 ランダム化は、「ここに 1 つ、そこに 1 つ」の原則に従って採卵時に行われます。
• パイロット研究の結果 この前向きランダム化試験を開始する前に、受精率が授精濃度の低下によって影響されないかどうかを確認するためのパイロット研究を実施しました。 このパイロット研究には、21 人の患者の 268 個の卵母細胞が含まれました。 良好な予後（前周期の受精率が少なくとも70％、良好な精子パラメーターとして定義：処理後の1mlあたり少なくとも10×106個の運動精子、および最小60％の運動精子）を持つ患者のみが選択されました。 まず、授精濃度を半分にしました。 1 ml あたり 600,000 個の精子の代わりに 1 ml あたり 300,000 個の精子で授精した場合でも、受精率は大きく変化しませんでした (75.9% 対 68.7%; p<0.05)。 パイロット研究の第 2 部では、濃度を 150,000/ml に下げました。 精子数の減少による受精率の低下はありませんでした（15万個のグループでは76.6％、60万個のグループでは83.6％；p<0.05）。 2日目に、良質な胚の数の10パーセントの増加が認められました（15万個のグループでは4細胞胚が53.1％だったのに対し、60万個のグループでは42.6％；p<0.05）。 しかし、3日目には、この小さなグループでは良質な胚の数に差は観察されませんでした（150,000グループの32.7％に対し、600,000グループでは36.1％；p<0.05）。 このパイロット研究では、授精のための精子濃度を低下させても受精率は低下せず、胚の発育に有益な効果がある可能性があることが示されましたが、この傾向を確認するにはさらに多くの患者を研究する必要があります。
• 精子の調製 精子サンプルは、密度勾配遠心分離技術を使用して調製されます。 サンプルを Isolate 勾配にロードし、1450 rpm で 20 分間遠心分離します。 得られたペレットを遠心分離により２回洗浄する。 その後、ペレットを０．７５ｍｌの受精培地に再懸濁する。 計数後、サンプルは 1 ml あたり 10 x 106 個の運動精子の最終濃度に希釈されます (これは高授精グループに使用される濃度です)。 低授精グループの場合、精子サンプルは 1 ml あたり 2.5 x 106 個の運動精子の濃度に再度希釈されます。
• 胚の培養と移植 卵母細胞の吸引中に、卵母細胞は 2 つのグループに分けられます。 卵母細胞は、最大 5 個の卵母細胞を含む 750 μl の受精培地に配置されます。 37℃でインキュベートした後、低濃度または高濃度の精子サンプルを30μl加えて卵母細胞に授精します。 受精は、授精後 18 ～ 20 時間後に評価されます。 胚の品質は 2、3、5 日目に評価されます (卵割期、形態および対称性)。 受精卵の数と前の周期の数に応じて、胚移植は2日目、3日目、または5日目に行われます。 ベルギー法の移植方針 (Koninklijk Besluit、2003 年 7 月 1 日) によれば、(卵割段階、形態、対称性に基づいて) 最良の胚が子宮に移植されます。 移植当日、十分な品質の余剰胚はすべて凍結保存されます。
• 結果変数と検出力の計算 この研究の主な結果変数は、2 日目と 3 日目 (7 細胞期または 8 細胞期) の良質な胚の数によって評価される胚の発育です。 低授精濃度（150,000/ml精子）のグループにおける7〜8個の細胞胚の割合が、高授精濃度のグループ（30％）よりも有意に高い（40％）という仮説を検証するため)、検出力の計算により、3 日目に各グループで 299 個の胚が必要であることが明らかになりました (ベータ = 0.8、アルファ <0.05)。 この研究の他の結果変数は、移植胚あたりの受精率、多精子症の発生率、妊娠率および着床率です。