Efecto del número de espermatozoides inseminados en el desarrollo embrionario humano subsiguiente in vitro

FONDO

En los procedimientos de fecundación humana in vitro, los ovocitos suelen inseminarse con concentraciones que varían entre 50 000 y 150 000 espermatozoides por ml de medio de fecundación. Se ha demostrado que al aumentar la concentración de espermatozoides a >200 000 por ml, se reducen las tasas de fecundación (66,7 % en el grupo inseminado con 200 000 espermatozoides/ml versus 79,7 % en el grupo inseminado con 10 000 espermatozoides/ml). 90 000/ml, p<0,001) (Mahadevan y Trounson, 1984). Estos resultados fueron confirmados por otro estudio (Diamond, Rogers et al., 1985). La razón de esta disminución de la tasa de fertilización no está clara, pero se ha especulado que la presencia de altas concentraciones de productos del metabolismo o degradación de los espermatozoides asociados con un mayor número de espermatozoides puede afectar negativamente la viabilidad de los espermatozoides y los ovocitos. Dumoulin et al. 1992 mostró que el aumento de la concentración de espermatozoides afecta no solo la tasa de fertilización sino también el desarrollo del embrión (Dumoulin, Bras et al., 1992). Se encontraron significativamente menos embriones de desarrollo rápido (etapas de 4 células y de 5 a 8 células) el día 2 en el grupo de 100 000/ml (53,4 %) que en el grupo de 50 000/ml (65,5 %; p<0,05). ).

En el Centro de Fertilidad de la Universidad de Lovaina (LUFC), los ovocitos han sido inseminados tradicionalmente durante más de 15 años con una concentración de espermatozoides más alta (600 000/ml de espermatozoides) que las concentraciones promedio publicadas (50 000 a 200 000 espermatozoides móviles/ml) (Chen y Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Esta mayor concentración para la inseminación puede ser la causa de la menor tasa de embriones de 8 células en el día 3 observado en el LUFC cuando en comparación con la literatura. En el LUFC, solo el 20% de los embriones alcanzan la etapa de 8 células el día 3. En la literatura, se ha informado que la proporción de embriones de 8 células en el día 3 está entre el 30 y el 37 % (Chen y Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

En este ensayo aleatorio prospectivo probaremos la hipótesis de que el desarrollo del embrión puede mejorarse al reducir la concentración de espermatozoides en la inseminación. Este será el primer ensayo aleatorizado que muestre el efecto de la inseminación con 600 000 espermatozoides/ml en el desarrollo del embrión en el día 3.

MATERIALES Y MÉTODOS

• Pacientes Se incluirán en este estudio todas las pacientes con al menos cuatro ovocitos. Además, para su inclusión en el estudio, la muestra de semen el día de la recogida debe tener un recuento de motilidad total después del procesamiento de al menos 10 x 106/ml. Todos los pacientes de ICSI serán excluidos de este estudio.
• Aleatorización Para cada paciente, todos los ovocitos se asignarán aleatoriamente a la concentración de inseminación baja (150 000/ml) o la concentración alta (600 000/ml). La aleatorización se realizará en el momento de la extracción de los ovocitos según el principio "uno aquí - uno allá".
• Resultados del estudio piloto Antes de comenzar este ensayo prospectivo aleatorizado, realizamos un estudio piloto para verificar si la tasa de fertilización no estaba influenciada por la reducción de la concentración de inseminación. En este estudio piloto se incluyeron 268 ovocitos de 21 pacientes. Solo se seleccionaron pacientes con buen pronóstico (definido como una tasa de fecundación de al menos el 70 % en el ciclo anterior y buenos parámetros espermáticos: al menos 10 x 106 espermatozoides móviles por ml después del procesamiento y un mínimo del 60 % de espermatozoides móviles) fueron seleccionados. Al principio, la concentración de inseminación se redujo a la mitad. La tasa de fertilización no cambió significativamente cuando inseminamos con 300 000 espermatozoides por ml en lugar de 600 000 por ml (75, 9% versus 68,7%; p<0,05). En la segunda parte del estudio piloto, la concentración se redujo a 150 000/ml. No hubo disminución en la tasa de fecundación con el número reducido de espermatozoides (76,6% en el grupo de 150 000 versus 83,6% en el grupo de 600 000; p<0,05). En el día 2 se observó un aumento del 10 por ciento en el número de embriones de buena calidad (53,1 % de embriones de 4 células en el grupo de 150 000 versus 42,6 % en el grupo de 600 000; p<0,05). Pero en el día 3 no se observó diferencia en el número de embriones de buena calidad en este pequeño grupo (32,7% en el grupo de 150 000 versus 36,1% en el grupo de 600 000; p<0,05). Este estudio piloto mostró que la reducción de la concentración de espermatozoides para la inseminación no reduce la tasa de fertilización y puede tener un efecto beneficioso sobre el desarrollo del embrión, pero es necesario estudiar a más pacientes para confirmar esta tendencia.
• Preparación de esperma Las muestras de esperma se preparan mediante una técnica de centrifugación en gradiente de densidad. Las muestras se cargan en un gradiente de Isolate y se centrifugan a 1450 rpm durante 20 minutos. El sedimento resultante se lava dos veces por centrifugación. Posteriormente, el sedimento se resuspende en 0,75 ml de medio de fertilización. Después del conteo, la muestra se diluye a una concentración final de 10 x 106 espermatozoides móviles por ml (esta es la concentración utilizada para el grupo de alta inseminación). Para el grupo de baja inseminación, la muestra de semen se diluirá nuevamente a una concentración de 2,5 x 106 espermatozoides móviles por ml.
• Cultivo y transferencia de embriones Durante la aspiración de ovocitos, los ovocitos se dividirán en dos grupos. Los ovocitos se colocan en 750 µl de medio de fertilización con un máximo de 5 ovocitos. Después de la incubación a 37°C, los ovocitos se inseminan añadiendo 30 µl de la muestra de esperma con la concentración baja o alta. La fertilización se evalúa 18-20h después de la inseminación. La calidad embrionaria se evalúa los días 2, 3 y 5 (etapa de clivaje, morfología y simetría). Dependiendo del número de ovocitos fecundados y del número de ciclos anteriores, la transferencia de embriones se realiza el día 2, 3 o el día 5. De acuerdo con la política de transferencia de la ley belga (Koninklijk Besluit, 1 de julio de 2003), los mejores embriones (según el estadio de segmentación, la morfología y la simetría) se transfieren al útero. El día de la transferencia se criopreservan todos los embriones excedentes de calidad suficiente.
• Variables de resultado y cálculo de potencia La variable de resultado principal de este estudio es el desarrollo del embrión evaluado por el número de embriones de buena calidad en el día 2 y el día 3 (en etapa de 7 u 8 células). Para probar la hipótesis de que el porcentaje de 7 a 8 células-embriones en el grupo con baja concentración de inseminación (150 000/ml de espermatozoides) es significativamente mayor (40 %) que el porcentaje del grupo con alta concentración de inseminación (30 % ), el cálculo de potencia reveló que se necesitan 299 embriones en cada grupo en el día 3 (beta= 0,8 y alfa <0,05). Otras variables de resultado de este estudio son la tasa de fertilización, la incidencia de poliespermia, la tasa de embarazo y la tasa de implantación por embrión transferido.