Efeito do número de espermatozoides inseminados no desenvolvimento embrionário humano subsequente in vitro

FUNDO

Em procedimentos de fertilização humana in vitro, os oócitos são geralmente inseminados com concentrações que variam entre 50.000 e 150.000 espermatozóides por ml de meio de fertilização. Foi demonstrado que o aumento da concentração de espermatozóides para >200.000 por ml resulta em taxas de fertilização diminuídas (66,7% no grupo inseminado com 200.000 espermatozóides/ml versus 79,7% no grupo inseminado com 10.000- 90 000/ml; p<0,001) (Mahadevan e Trounson, 1984). Esses resultados foram confirmados por outro estudo (Diamond, Rogers et al., 1985). A razão para esta diminuição da taxa de fertilização não é clara, mas especula-se que a presença de altas concentrações de produtos do metabolismo do esperma ou de degradação associados a um maior número de espermatozóides pode afetar adversamente a viabilidade do esperma e do oócito. Dumoulin et ai. 1992 mostraram que o aumento da concentração de espermatozóides afeta não apenas a taxa de fertilização, mas também o desenvolvimento do embrião (Dumoulin, Bras et al., 1992). Significativamente menos embriões de desenvolvimento rápido (estágios de 4 células e 5 a 8 células) foram encontrados no dia 2 no grupo de 100.000/ml (53,4%) do que no grupo de 50.000/ml (65,5%; p<0,05 ).

No Centro de Fertilidade da Universidade de Leuven (LUFC), os oócitos têm sido inseminados tradicionalmente há mais de 15 anos com uma concentração de espermatozóides mais alta (600.000/ml espermatozóides) do que as concentrações médias publicadas (50.000 a 200.000 espermatozóides móveis/ml) (Chen e Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Esta maior concentração para a inseminação pode ser a causa da menor taxa de embriões de 8 células no dia 3 observada no LUFC quando comparada com a literatura. No LUFC apenas 20% dos embriões atingem o estágio de 8 células no dia 3. Na literatura, a proporção de embriões de 8 células no dia 3 foi relatada entre 30 e 37% (Chen e Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

Neste estudo prospectivo randomizado, testaremos a hipótese de que o desenvolvimento do embrião pode ser melhorado reduzindo a concentração de espermatozoides na inseminação. Este será o primeiro estudo randomizado mostrando o efeito da inseminação com 600.000 espermatozóides/ml no desenvolvimento do embrião no dia 3.

MATERIAIS E MÉTODOS

• Pacientes Todas as pacientes com pelo menos quatro ovócitos serão incluídas neste estudo. Além disso, para inclusão no estudo, a amostra de sêmen no dia da coleta precisa ter uma contagem total de motilidade após o processamento de pelo menos 10 x 106 /ml. Todos os pacientes com ICSI serão excluídos deste estudo.
• Randomização Para cada paciente, todos os oócitos serão aleatoriamente designados para a baixa concentração de inseminação (150.000/ml) ou alta concentração (600.000/ml). A randomização será feita no momento da captação dos ovócitos de acordo com o princípio "um aqui - um ali".
• Resultados do estudo piloto Antes de iniciar este estudo prospectivo randomizado, realizamos um estudo piloto para verificar se a taxa de fertilização não foi influenciada pela redução da concentração de inseminação. 268 oócitos de 21 pacientes foram incluídos neste estudo piloto. Apenas pacientes com bom prognóstico (definido como uma taxa de fertilização de pelo menos 70% no ciclo anterior e bons parâmetros espermáticos: pelo menos 10 x 106 espermatozóides móveis por ml após o processamento e mínimo de 60% de espermatozóides móveis) foram selecionados. No início, a concentração de inseminação foi reduzida pela metade. A taxa de fertilização não se alterou significativamente quando inseminamos com 300 000 espermatozóides por ml em vez de 600 000 por ml (75,9% versus 68,7%; p<0,05). Na segunda parte do estudo piloto, a concentração foi reduzida para 150 000/ml. Não houve diminuição na taxa de fertilização com a redução do número de espermatozoides (76,6% no grupo de 150.000 versus 83,6% no grupo de 600.000; p<0,05). No dia 2 notou-se um aumento de 10 por cento no número de embriões de boa qualidade (53,1% embriões de 4 células no grupo de 150.000 versus 42,6% no grupo de 600.000; p<0,05). Mas no dia 3 nenhuma diferença no número de embriões de boa qualidade foi observada neste pequeno grupo (32,7% no grupo de 150.000 versus 36,1% no grupo de 600.000; p<0,05). Este estudo piloto mostrou que diminuir a concentração de esperma para inseminação não reduz a taxa de fertilização e pode ter um efeito benéfico no desenvolvimento do embrião, mas mais pacientes precisam ser estudados para confirmar essa tendência
• Preparação de esperma As amostras de esperma são preparadas usando uma técnica de centrifugação de gradiente de densidade. As amostras são carregadas em um gradiente Isolate e centrifugadas a 1450 rpm por 20 minutos. O pellet resultante é lavado duas vezes por centrifugação. Em seguida, o pellet é ressuspenso em 0,75 ml de meio de fertilização. Após a contagem, a amostra é diluída para uma concentração final de 10 x 106 espermatozóides móveis por ml (esta é a concentração usada para o grupo de alta inseminação). Para o grupo de baixa inseminação, a amostra de esperma será novamente diluída para uma concentração de 2,5 x 106 espermatozóides móveis por ml.
• Cultura e transferência do embrião Durante a aspiração do oócito, os oócitos serão divididos em dois grupos. Os oócitos são colocados em 750 µl de meio de fertilização com no máximo 5 oócitos. Após incubação a 37°C, os oócitos são inseminados pela adição de 30 µl da amostra de esperma com concentração baixa ou alta. A fertilização é avaliada 18-20h após a inseminação. A qualidade do embrião é avaliada no dia 2, 3 e 5 (estágio de clivagem, morfologia e simetria). Dependendo do número de oócitos fertilizados e do número de ciclos anteriores, a transferência de embriões é realizada no dia 2, 3 ou dia 5. De acordo com a política de transferência da lei belga (Koninklijk Besluit, 1 de julho de 2003), os melhores embriões (com base no estágio de clivagem, morfologia e simetria) são transferidos para o útero. No dia da transferência, todos os embriões excedentes de qualidade suficiente são criopreservados.
• Variáveis ​​de resultado e cálculo de poder A variável de resultado principal deste estudo é o desenvolvimento do embrião avaliado pelo número de embriões de boa qualidade no dia 2 e no dia 3 (no estágio de 7 ou 8 células). Para testar a hipótese de que a porcentagem de 7 a 8 células-embriões no grupo com baixa concentração de inseminação (150 000/ml espermatozoides) é significativamente maior (40%) do que a porcentagem do grupo com alta concentração de inseminação (30% ), o cálculo do poder revelou que são necessários 299 embriões em cada grupo no dia 3 (beta= 0,8 e alfa <0,05). Outras variáveis ​​de resultado deste estudo são a taxa de fertilização, a incidência de polispermia, taxa de gravidez e taxa de implantação por embrião transferido.