Effekt af antallet af inseminerede spermatozoer på efterfølgende menneskelig embryonal udvikling in vitro

BAGGRUND

Ved humane in vitro-befrugtningsprocedurer insemineres oocytter sædvanligvis med koncentrationer, der varierer mellem 50 000 og 150 000 spermatozoer pr. ml befrugtningsmedium. Det har vist sig, at en stigning i koncentrationen af ​​spermatozoer til >200 000 pr. ml resulterer i nedsatte befrugtningsrater (66,7 % i gruppen insemineret med 200 000 spermatozoer/ml mod 79,7 % i gruppen insemineret med 10 000- 90.000/ml; p<0.001) (Mahadevan og Trounson, 1984). Disse resultater blev bekræftet af en anden undersøgelse (Diamond, Rogers et al., 1985). Årsagen til denne nedsatte befrugtningshastighed er uklar, men det er blevet spekuleret i, at tilstedeværelsen af ​​høje koncentrationer af sædmetabolisme eller nedbrydningsprodukter forbundet med et større antal spermatozoer kan have en negativ indvirkning på sæd- og oocytlevedygtighed. Dumoulin et al. 1992 viste, at forøgelse af sædkoncentrationen påvirker ikke kun befrugtningshastigheden, men også embryoudviklingen (Dumoulin, Bras et al., 1992). Signifikant færre hurtigt udviklende embryoner (4-celle- og 5- til 8-celle-stadier) blev fundet på dag 2 i 100 000/ml-gruppen (53,4 %) end i 50 000/ml-gruppen (65,5 %; p<0,05 ).

På Leuven University Fertility Centre (LUFC) er oocytter traditionelt blevet insemineret i mere end 15 år nu med en højere sædkoncentration (600 000/ml spermatozoer) end de offentliggjorte gennemsnitlige koncentrationer (50 000 til 200 000 bevægelige sædceller/ml) (Chen) og Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et al., 1992; Racowsky, Combelles et al., 2003) Denne højere koncentration til inseminationen kan være årsagen til den lavere frekvens af 8-celle embryoner på dag 3 observeret på LUFC, når sammenlignet med litteraturen. På LUFC når kun 20% af embryonerne 8-cellestadiet på dag 3. I litteraturen er andelen af ​​8 celle embryoner på dag 3 blevet rapporteret til at være mellem 30 og 37 % (Chen og Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et al., 2003; Racowsky, Orasanu et al., 2005).

I dette prospektive randomiserede forsøg vil vi teste hypotesen om, at embryoudvikling kan forbedres ved at reducere sædkoncentrationen ved insemination. Dette vil være det første randomiserede forsøg, der viser effekten af ​​inseminering med 600.000 spermatozoer/ml på embryoudviklingen på dag 3.

MATERIALER OG METODER

• Patienter Alle patienter med mindst fire oocytter vil blive inkluderet i denne undersøgelse. For at blive inkluderet i undersøgelsen skal sædprøven på afhentningsdagen desuden have en total motilitetstal efter forarbejdning på mindst 10 x 106/ml. Alle ICSI-patienter vil blive udelukket fra denne undersøgelse.
• Randomisering For hver patient vil alle oocytter blive tilfældigt tildelt den lave inseminationskoncentration (150.000/ml) eller den høje koncentration (600.000/ml). Randomiseringen vil ske på tidspunktet for oocytudtagning efter princippet "en her - en der".
• Resultater fra pilotundersøgelse Inden vi starter dette prospektive randomiserede forsøg, har vi gennemført et pilotstudie for at kontrollere, om befrugtningsraten ikke var påvirket af reduktionen af ​​inseminationskoncentrationen. 268 oocytter af 21 patienter blev inkluderet i denne pilotundersøgelse. Kun patienter med en god prognose (defineret som en befrugtningsrate på mindst 70 % i den foregående cyklus og gode sædparametre: mindst 10 x 106 bevægelige spermatozoer pr. ml efter bearbejdning og minimum 60 % bevægelige spermatozoer) blev udvalgt. I første omgang blev inseminationskoncentrationen halveret. Befrugtningsraten ændrede sig ikke væsentligt, da vi inseminerede med 300.000 spermatozoer pr. ml i stedet for med 600.000 pr. ml (75, 9% mod 68,7%; p<0,05). I den anden del af pilotundersøgelsen blev koncentrationen sænket til 150 000/ml. Der var intet fald i befrugtningsraten med det reducerede antal spermatozoer (76,6 % i 150.000-gruppen versus 83,6 % i 600.000-gruppen; p<0,05). På dag 2 blev der bemærket en stigning på 10 procent i antallet af embryoner af god kvalitet (53,1 % 4-celle embryoner i 150.000-gruppen versus 42,6 % i 600.000-gruppen; p<0,05). Men på dag 3 blev der ikke observeret nogen forskel i antallet af embryoner af god kvalitet i denne lille gruppe (32,7 % i 150 000-gruppen versus 36,1 % i 600 000-gruppen; p<0,05). Denne pilotundersøgelse viste, at sænkning af sædkoncentrationen til insemination ikke reducerer befrugtningshastigheden og kan have en gavnlig effekt på embryoudvikling, men flere patienter skal undersøges for at bekræfte denne tendens.
• Spermforberedelse Spermprøver fremstilles ved hjælp af en tæthedsgradientcentrifugeringsteknik. Prøverne fyldes på en Isolate-gradient og centrifugeres ved 1450 rpm i 20 minutter. Den resulterende pellet vaskes to gange ved centrifugering. Derefter resuspenderes pelleten i 0,75 ml gødningsmedium. Efter optælling fortyndes prøven til en slutkoncentration på 10 x 106 bevægelige spermatozoer pr. ml (dette er den koncentration, der anvendes til gruppen med høj insemination). For lavinsemineringsgruppen vil sædprøven blive fortyndet igen til en koncentration på 2,5 x 106 bevægelige spermatozoer pr. ml.
• Embryokultur og -overførsel Under oocytaspirationen vil oocytterne blive opdelt i to grupper. Oocytterne placeres i 750 µl befrugtningsmedium med maksimalt 5 oocytter. Efter inkubation ved 37°C insemineres oocytter ved at tilsætte 30 µl af sædprøven med enten den lave eller den høje koncentration. Befrugtning evalueres 18-20 timer efter inseminationen. Embryokvalitet evalueres på dag 2, 3 og 5 (spaltningsstadiet, morfologi og symmetri). Afhængigt af antallet af befrugtede oocytter og antallet af tidligere cyklusser udføres embryooverførsel på dag 2, 3 eller dag 5. I henhold til den belgiske lovs overførselspolitik (Koninklijk Besluit, 1. juli 2003) overføres det eller de bedste embryoner (baseret på spaltningsstadiet, morfologi og symmetri) ind i livmoderen. På overførselsdagen kryokonserveres alle overskydende embryoner af tilstrækkelig kvalitet.
• Udfaldsvariable og kraftberegning Den primære udfaldsvariabel for denne undersøgelse er embryoudviklingen evalueret ved antallet af embryoner af god kvalitet på dag 2 og dag 3 (i 7- eller 8-cellestadiet). For at teste hypotesen om, at procentdelen af ​​7 til 8 celleembryoner i gruppen med den lave inseminationskoncentration (150.000/ml spermatozoer) er signifikant højere (40%) end procentdelen af ​​gruppen med den høje inseminationskoncentration (30% ), viste kraftberegning, at der er behov for 299 embryoner i hver gruppe på dag 3 (beta= 0,8 og alfa <0,05). Andre udfaldsvariabler i denne undersøgelse er befrugtningsraten, forekomsten af ​​polyspermi, graviditetsraten og implantationshastigheden pr. overført embryo.