Siemennettyjen siittiöiden määrän vaikutus myöhempään ihmisen alkionkehitykseen in vitro

TAUSTA

Ihmisen koeputkihedelmöityksessä munasoluja siemennetään yleensä pitoisuuksilla, jotka vaihtelevat välillä 50 000 - 150 000 siittiötä millilitrassa hedelmöityselatusainetta. On osoitettu, että siittiöiden pitoisuuden lisääminen > 200 000/ml:iin johtaa hedelmöitysasteen laskuun (66,7 % 200 000 siittiötä/ml siemennetyssä ryhmässä vs. 79,7 % 10 000 siittiöllä siemennetyssä ryhmässä 90 000/ml, p < 0 001) (Mahadevan ja Trounson, 1984). Nämä tulokset vahvistettiin toisessa tutkimuksessa (Diamond, Rogers et ai., 1985). Syy tähän alentuneeseen hedelmöitysasteeseen on epäselvä, mutta on arveltu, että siittiöiden aineenvaihdunnan tai hajoamistuotteiden korkeiden pitoisuuksien läsnäolo, joka liittyy suurempaan siittiömäärään, voi vaikuttaa haitallisesti siittiöiden ja munasolujen elinkykyyn. Dumoulin et ai. 1992 osoitti, että siittiöiden pitoisuuden lisääminen ei vaikuta ainoastaan ​​hedelmöitysasteeseen, vaan myös alkion kehitykseen (Dumoulin, Bras et al., 1992). Huomattavasti vähemmän nopeasti kehittyviä alkioita (4-soluiset ja 5-8-soluiset vaiheet) havaittiin päivänä 2 100 000/ml ryhmässä (53,4 %) kuin 50 000/ml ryhmässä (65,5 %; p<0,05 ).

Leuvenin yliopiston hedelmällisyyskeskuksessa (LUFC) munasoluja on siemennetty perinteisesti jo yli 15 vuoden ajan korkeammalla siittiöpitoisuudella (600 000/ml siittiötä) kuin julkaistut keskimääräiset pitoisuudet (50 000 - 200 000 liikkuvaa siittiötä/ml) (Chen) ja Kattera, 2006; Dumoulin, Bras et ai., 1992; Racowsky, Combelles et ai., 2003) Tämä korkeampi pitoisuus inseminaatiossa saattaa olla syynä 8-soluisten alkioiden alhaisempaan määrään päivänä 3, joka havaittiin LUFC:ssa, kun kirjallisuuteen verrattuna. LUFC:ssä vain 20 % alkioista saavuttaa 8-soluisen vaiheen päivänä 3. Kirjallisuudessa 8 solualkion osuuden päivänä 3 on raportoitu olevan 30-37 % (Chen ja Kattera, 2006; Racowsky, Combelles et ai., 2003; Racowsky, Orasanu et ai., 2005).

Tässä prospektiivisessa satunnaistetussa tutkimuksessa testaamme hypoteesia, että alkion kehitystä voidaan parantaa vähentämällä siittiöiden pitoisuutta inseminaatiossa. Tämä on ensimmäinen satunnaistettu koe, joka osoittaa 600 000 siittiötä/ml keinosiemennyksen vaikutuksen alkion kehitykseen päivänä 3.

MATERIAALIT JA MENETELMÄT

• Potilaat Kaikki potilaat, joilla on vähintään neljä munasolua, otetaan mukaan tähän tutkimukseen. Lisäksi tutkimukseen sisällyttämistä varten siemennestenäytteen kokonaisliikkuvuuden on oltava käsittelyn jälkeen vähintään 10 x 106/ml keräyspäivänä. Kaikki ICSI-potilaat suljetaan pois tästä tutkimuksesta.
• Satunnaistaminen Jokaisen potilaan kaikki munasolut luokitellaan satunnaisesti alhaiseen inseminaatiopitoisuuteen (150 000/ml) tai korkeaan pitoisuuteen (600 000/ml). Satunnaistaminen tehdään oosyyttihaun yhteydessä periaatteen "yksi täällä - yksi siellä" mukaisesti.
• Pilottitutkimuksen tulokset Ennen tämän prospektiivisen satunnaistetun kokeen aloittamista olemme tehneet pilottitutkimuksen tarkistaaksemme, eikö siemennyspitoisuuden aleneminen vaikuttanut hedelmöityssuhteeseen. Tähän pilottitutkimukseen osallistui 268 munasolua 21 potilaasta. Valittiin vain potilaat, joilla oli hyvä ennuste (määritelty hedelmöitysasteeksi edellisessä syklissä vähintään 70 % ja siittiöparametrit hyvät: vähintään 10 x 106 liikkuvaa siittiötä millilitrassa käsittelyn jälkeen ja vähintään 60 % liikkuvia siittiöitä). Aluksi keinosiemennyspitoisuus puolitettiin. Hedelmöitysaste ei muuttunut merkittävästi, kun siemennettiin 300 000 siittiötä/ml 600 000 siittiötä/ml sijaan (75,9 % vs. 68,7 %; p<0,05). Pilottitutkimuksen toisessa osassa pitoisuus laskettiin arvoon 150 000/ml. Hedelmöitysaste ei laskenut siittiöiden vähentyessä (76,6 % 150 000 ryhmässä vs. 83,6 % 600 000 ryhmässä; p < 0,05). Toisena päivänä hyvälaatuisten alkioiden lukumäärässä havaittiin 10 prosentin kasvu (53,1 % 4-soluisia alkioita 150 000 ryhmässä vs. 42,6 % 600 000 ryhmässä; p<0,05). Mutta päivänä 3 ei havaittu eroa hyvälaatuisten alkioiden määrässä tässä pienessä ryhmässä (32,7 % 150 000 ryhmässä vs. 36,1 % 600 000 ryhmässä; p < 0,05). Tämä pilottitutkimus osoitti, että siittiöiden pitoisuuden alentaminen inseminaatiota varten ei vähennä hedelmöitysnopeutta ja sillä voi olla suotuisa vaikutus alkionkehitykseen, mutta lisää potilaita on tutkittava tämän suuntauksen vahvistamiseksi.
• Siittiöiden valmistus Siittiönäytteet valmistetaan käyttämällä tiheysgradienttisentrifugointitekniikkaa. Näytteet ladataan Isolate-gradientille ja sentrifugoidaan nopeudella 1450 rpm 20 minuuttia. Saatu pelletti pestään kahdesti sentrifugoimalla. Sen jälkeen pelletti suspendoidaan uudelleen 0,75 ml:aan lannoitusalustaa. Laskennan jälkeen näyte laimennetaan lopulliseen konsentraatioon 10 x 106 liikkuvaa siittiötä ml:ssa (tätä pitoisuutta käytetään korkean keinosiemennysryhmän kohdalla). Vähäsiemennysryhmässä siittiönäyte laimennetaan uudelleen pitoisuuteen 2,5 x 106 liikkuvaa siittiötä ml:aa kohti.
• Alkion viljely ja siirto Oosyyttiaspiraation aikana munasolut jaetaan kahteen ryhmään. Munasolut asetetaan 750 µl:aan hedelmöityselatusainetta, jossa on enintään 5 munasolua. 37 °C:ssa inkuboinnin jälkeen munasolut inseminoidaan lisäämällä 30 ui siittiönäytettä joko pienellä tai korkealla pitoisuudella. Hedelmöityminen arvioidaan 18-20 tuntia siemennyksen jälkeen. Alkion laatu arvioidaan päivinä 2, 3 ja 5 (katkaisuvaihe, morfologia ja symmetria). Hedelmöityneiden munasolujen lukumäärästä ja aiempien syklien määrästä riippuen alkionsiirto suoritetaan päivänä 2, 3 tai 5. Belgian lain (Koninklijk Besluit, 1. heinäkuuta 2003) siirtopolitiikan mukaan parhaat alkiot (katkaisuvaiheen, morfologian ja symmetrian perusteella) siirretään kohtuun. Siirtopäivänä kaikki riittävän laadukkaat ylimääräiset alkiot kylmäsäilytetään.
• Tulosmuuttujat ja teholaskenta Tämän tutkimuksen ensisijainen tulosmuuttuja on alkion kehitys arvioituna hyvälaatuisten alkioiden lukumääränä päivänä 2 ja 3 (7 tai 8 soluvaiheessa). Testaamaan hypoteesia, että 7-8 solualkioiden prosenttiosuus ryhmässä, jossa on alhainen siemennyspitoisuus (150 000/ml siittiöitä) on merkittävästi suurempi (40 %) kuin prosenttiosuus ryhmässä, jonka siemennyspitoisuus oli korkea (30 % ), teholaskenta paljasti, että jokaisessa ryhmässä tarvitaan 299 alkiota päivänä 3 (beta = 0,8 ja alfa <0,05). Muita tämän tutkimuksen tulosmuuttujia ovat hedelmöitysaste, polyspermian esiintyvyys, raskausaste ja implantaatioaste siirrettyä alkiota kohti.