보툴리눔 독소 A가 만성 척수 손상 환자의 신경인성 배뇨근 과활성에 미치는 영향

최근 수십 년 동안 onabotulinumtoxinA로 신경인성 배뇨근 과활동(NDO)을 치료하는 것이 척수 손상(SCI) 또는 다발성 경화증으로 인한 비뇨기과 합병증 관리를 위한 대체 방법으로 부상했습니다. 배뇨근에 200-300 U의 onabotulinumtoxinA를 주입하면 NDO 환자의 수축성을 감소시키고 방광 순응도를 개선하며 요실금을 회복할 수 있습니다. 그러나, 300 U의 onabotulinumtoxinA 주사 후 배뇨근 기능저하가 발생하고 요역동학 및 삶의 질 매개변수가 9개월 동안 지속되었습니다. 현재 배뇨근에 onabotulinumtoxinA를 200U 단일 주입하는 것이 NDO의 표준 치료법으로 권장되고 있습니다. 그러나 NDO에 대한 이 용량의 치료 기간은 300U 주사보다 짧았습니다.

OnabotulinumtoxinA는 신경근 및 신경선 접합부에서 신호 전달을 억제하여 하부 요로 증상을 효과적으로 개선합니다. OnabotulinumtoxinA는 시냅토솜 관련 단백질 25를 절단하고 신경 전달 물질 함유 소포와 신경 벽의 융합을 방해하여 신호 전달을 억제합니다. 방광에서, onabotulinumtoxinA 투여 후 부교감 신경절 전 및 후 부교감 신경 모두에서 아세틸콜린의 방출이 차단됩니다. 이 독소는 또한 NDO 환자의 절박성 및 절박성 요실금 증상 감소와 관련된 방광의 구심성 활동을 조절하는 것으로 밝혀졌습니다. onabotulinumtoxinA가 방광 내 교감신경계에 미치는 영향은 불분명하지만, 방광 경부 수축과 배뇨근 이완을 각각 조절하는 α- 및 β3-아드레날린 수용체(β3-AR)로의 노르에피네프린 방출을 억제하는 효과가 있습니다.

이전 연구에서는 접착 및 접합 단백질 E-cadherin 및 zonula occludens-1 (ZO-1)의 발현 감소와 만성 SCI 방광 환자의 세포 사멸로 인한 요로 상피 염증 증가를보고했습니다. SCI 방광의 요로 상피 염증 및 기능 장애는 또한 purinergic 수용체 P2X3, 일시적 수용체 전위 발리노이드 수용체 서브패밀리 1, 아데노신 삼인산 및 산화질소와 같은 감각 단백질 발현을 변경합니다. Urothelial 기능 장애는 SCI 후 주로 배뇨 반사의 구 심성 신경이되는 C 섬유의 흥분성을 증가시킬 수 있습니다. NDO가 있는 사람의 경우 배뇨근 onabotulinumtoxinA 주사 후 방광 P2X2, P2X3 및 무스카린 수용체 M2 및 M3 수치가 감소했으며, 이는 이 독소가 배뇨 반사의 감각 및 운동 팔을 모두 억제하여 DO를 억제함을 시사합니다. 또한, β3-AR은 동물 및 인간의 방광에서 배뇨근 이완을 유도하여 방광에서 소변 저장을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 인간에서 β3-AR은 방광에서 우세한 β-수용체 아형입니다. onabotulinumtoxin 치료 전후 SCI 방광 요로 상피의 β3-AR 변화에 대한보고는 없습니다.

onabotulinumtoxinA 주사 후 환자는 증상이 재발하기 전 3-6개월 동안 증상이 없을 수 있습니다. NDO에 대한 onabotulinumtoxinA에 대한 대부분의 연구는 동물 모델에서 나온 것이며 소수의 인간 연구만 언급되었습니다. 현재 연구는 SCI 환자에서 단일 onabotulinumtoxin 주사 후 시간에 따른 방광 요로 상피의 요로 상피 기능 장애 및 감각 단백질 발현의 변화를 조사했습니다.

재료 및 방법

NDO 및 요실금을 유발하는 만성 SCI 환자 총 26명을 배뇨근에 200U onabotulinumtoxinA를 단회 주사하여 치료했습니다. 모든 환자는 방광을 비우기가 어렵거나 그렇지 않은 요실금을 보였습니다. 배뇨근 주사를 받은 환자에서 치료 후 가능한 요로 관리 방식으로 깨끗한 간헐적 카테터 삽입이 제안되었습니다. 현재 연구는 불교 Tzu Chi 종합 병원의 기관 검토 위원회 및 윤리 위원회(IRB:098-53)의 승인을 받았습니다. 각 환자에게 연구 근거 및 절차에 대한 정보를 제공했으며 방광 시술 전에 참여에 대한 서면 동의서를 얻었습니다.

비디오 유로다이내믹 연구

모든 환자는 등록 전에 비디오 유로다이내믹 연구(VUDS)를 받았습니다. 방광 및 요도 기능 장애는 협응 또는 이상동조성 요도 괄약근 활동이 있는 DO의 존재로 분류되었습니다. 요로 감염 환자는 onabotulinumtoxinA 주입 일정을 잡기 전에 적절하게 치료를 받았습니다. VUDS 결과는 International Continence Society의 권장 사항에 따라 해석되었습니다. VUDS 매개변수에는 최대 유속(Qmax), Qmax에서의 배뇨근 배뇨 압력(Pdet), 방광 측정 방광 용량(CBC), 배뇨 부피(Vol) 및 배뇨 후 잔류(PVR) 부피가 포함됩니다.

OnabotulinumtoxinA 주사

모든 환자는 수술실에서 20 mL 생리 식염수(BOTOX®, 100 U/vial, Allergan Inc., Irvine, USA)에 담긴 200 U의 onabotulinumtoxinA를 40명의 방광벽의 부위, 삼각근을 아끼기 주입 후 요도 폴리 카테터를 일상적으로 삽입하고 다음 날 아침 환자가 퇴원하기 전에 제거했습니다. 치료 후 3일 동안 광범위 항생제를 처방하였다.

onabotulinumtoxinA 주입 후, 방광 천공을 방지하기 위해 interureteric ridge에서 약 2cm 위의 후벽에서 무작위로 4개의 방광 콜드 컵 생검을 채취하고 방광 점막과 점막하 조직만을 채취했습니다. 홍반성 또는 염증성 방광 점막은 피했습니다. 암종의 가능성을 배제하기 위해 각 환자의 방광 생검 표본 하나를 병리과로 보냈습니다. 각 환자의 나머지 3개 표본은 추가 면역조직화학 연구를 위해 최적의 절단 온도와 액체 질소에 보관되었습니다.

환자 추적 및 결과 평가

환자들은 매달 OPD에서 추적 관찰되었고 VUDS와 방광 및 배뇨 상태 및 치료 만족도 평가는 치료 후 3개월 및 6개월에 수행되었습니다. CBC가 기준선 값에서 50% 증가하면 치료 결과가 성공한 것으로 간주됩니다. 그렇지 않으면 해당 시점에서 결과가 실패로 간주되었습니다. 잦은 절박감이 없는 스트레스 관련 요실금이 있는 10명의 여성 환자가 대조군으로 사용되었습니다. 모든 대조군 환자는 VUDS에 의해 방광출구 폐쇄 또는 DO가 없는 것으로 확인되었습니다. 요실금 방지 수술 중에 제어 방광 조직을 얻었고 SCI 환자와 동일하게 처리했습니다. 남성 환자는 전립선이 방광 출구 폐쇄를 유발하고 요로상피 기능에 영향을 미칠 수 있기 때문에 대조군으로 선택되지 않았습니다.

면역형광

SCI 환자 및 대조군의 방광 조직 샘플을 면역형광에 의해 요로상피 E-cadherin(접착 단백질), ZO-1(접합 단백질) 및 비만 세포 활성화(트립타제) 수준의 변화에 ​​대해 검사했습니다. 말단 deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling assay로 세포 사멸을 조사하였다. 이 절차는 6μm 두께의 조직 절편을 사용하여 이전 연구와 유사하게 수행되었습니다. 방광 표본을 인산염 완충 식염수(pH 7.4)에 녹인 얼음처럼 차가운 4% 포름알데히드에 1시간 동안 담그고 고정한 다음 15% 자당을 함유한 얼음처럼 차가운 인산염 완충 식염수로 12시간 동안 헹구었습니다. 생검 표본을 최적 절단 온도 매체에 내장하고 -80°C에서 보관했습니다. 시편당 4개의 섹션을 저온 유지 장치를 사용하여 8μm 두께로 절단하고 새로운 실란 III 코팅 유리 슬라이드(Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan)에 수집했습니다. 절편을 -20°C에서 아세톤으로 후고정하고 토끼 혈청으로 차단했습니다. 절편을 항인간 E-cadherin(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 또는 트립타제(Chemicon, Temecula, CA, USA) 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양했습니다. BPS에서 0.1% Tween-20으로 절편을 헹군 후 토끼 항마우스 접합 플루오레세인 이소티오시아네이트 2차 항체(DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Denmark)를 적용하고 1시간 동안 절편에서 배양했습니다. 마지막으로 섹션을 4',6-diamidino-2-phenylindole(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)로 대조염색했습니다. 음성 대조군에는 1차 항체의 이소형이 포함되었습니다. 각 표본 내에서 3개의 무작위 핫스팟을 사용하여 염색 강도 및 백분율 양성 영역 측정의 평균, 최대, 범위 및 표준 편차를 얻었습니다.

Immunofluorescence 정량화는 밀도가 가장 높은 영역에서 4개의 연속적인 고배율 필드(400X)에서 결정되었습니다. Immunofluorescence(tryptase 및 terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-labeling) 분석은 단위 면적(4 μm2)당 양성으로 염색된 세포의 수를 세어 정량화하고 백분율로 표시합니다. E-cadherin(형광 현미경) 및 ZO-1(공초점 현미경) 형광의 강도는 Image J를 사용하여 정량화되었습니다.

방광 점막 표본의 감각 단백질 수준을 평가하기 위해 Western blotting을 사용했습니다. 1차 항체에는 GeneTex의 P2X3(1:2000), 내피 산화질소 합성효소[eNOS](1:1000), M2(1:1000), M3(1:500) 및 GAPDH(1:100000; 내부 대조군)가 포함되었습니다. 미국 캘리포니아 어바인); 유도성 NOS[iNOS](1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); 및 β3-AR(1:1000; Abcam, Cambridge, UK). Donkey antigoat (β3-AR의 경우) 또는 염소 antirabbit (다른 모든 단백질의 경우) IgG-horseradish peroxidase (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) 2차 항체를 사용했습니다. 겔 전기영동 후 스캔된 필름은 겔 문서화 시스템(Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK). 절차는 이전 연구에서 설명한 것과 유사했습니다.

통계 분석

연속 변수는 평균±표준편차로, 범주형 데이터는 숫자와 백분율로 나타내었다. 적격 SCI 환자를 치료 결과에 따라 그룹화하고 대조군과 비교했습니다. onabotulinumtoxinA 주사 후 기준선과 3개월 및 6개월 후 요로상피의 기능성 단백질 수준의 차이는 쌍을 이룬 스튜던트 t-테스트를 ​​사용하여 분석되었습니다. Kruskal-Wallis 테스트를 사용하여 성공적인 치료군과 실패한 치료군 사이의 감각 단백질의 면역형광 및 웨스턴 블롯의 차이를 분석하였다. NDO에서 요로상피 감각 단백질의 역할을 명확히 하기 위해 VUDS 및 요로상피 기능장애 매개변수를 포함하여 선형 회귀를 사용한 상관 분석도 수행했습니다. 모든 계산은 Windows용 SPSS 버전 16.0(SPSS, Chicago, IL, USA)을 사용하여 수행되었습니다. P 값이 0.05 미만이면 차이가 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.