Botuliinitoksiini A:n vaikutus neurogeeniseen detrusorin yliaktiivisuuteen kroonisissa selkäydinvammautuneissa potilaissa

Viime vuosikymmeninä neurogeenisen detrusorin yliaktiivisuuden (NDO) hoito onabotulinumtoxinA:lla on noussut vaihtoehtoiseksi menetelmäksi selkäydinvauriosta (SCI) tai multippeliskleroosista johtuvien urologisten komplikaatioiden hallintaan. 200-300 U onabotulinumtoxinA:n injektio detrusor-lihakseen voi vähentää supistumiskykyä, parantaa virtsarakon myöntymistä ja palauttaa virtsanpidätyskyvyn NDO-potilailla. Detrusorin aliaktiivisuus kehittyy kuitenkin 300 U onabotulinumtoxinA:n injektion jälkeen ja urodynaamisten ja elämänlaatuparametrien paraneminen kesti 9 kuukautta. Tällä hetkellä 200 U:n kertainjektiota onabotulinumtoxinA:ta detrusoriin on suositeltu NDO:n standardihoitona. Tämän annoksen terapeuttinen kesto NDO:lla oli kuitenkin lyhyempi kuin 300 U:n injektiolla.

OnabotulinumtoxinA parantaa tehokkaasti alempien virtsateiden oireita estämällä signaalin välitystä hermo-lihas- ja hermorauhasliitoksissa. OnabotulinumtoxinA pilkkoo synaptosomeihin liittyvää proteiinia 25 ja estää signaalin välitystä häiritsemällä välittäjäaineita sisältävien rakkuloiden fuusiota hermosolun seinämän kanssa. Virtsarakossa asetyylikoliinin vapautuminen sekä pre- että postganglionisista parasympaattisista hermoista estyy onabotulinumtoxinA:n antamisen jälkeen. Tämän toksiinin havaittiin myös moduloivan virtsarakon afferenttia aktiivisuutta, joka liittyy vähentyneeseen kiireelliseen ja kiireelliseen virtsanpidätyskyvyttömyyden oireisiin NDO-potilailla. Vaikka onabotulinumtoxinA:n vaikutus sympaattiseen hermostoon virtsarakon sisällä on epäselvä, sillä on estävä vaikutus norepinefriinin vapautumiseen α- ja β3-adrenoreseptoreihin (β3-AR), jotka säätelevät virtsarakon kaulan supistumista ja detrusorin rentoutumista.

Aiempi tutkimus raportoi adheesio- ja liitosproteiinien E-kadheriinin ja zonula occludens-1:n (ZO-1) vähentyneen ilmentymisen ja lisääntyneen suburoteliaalisen tulehduksen ja apoptoosin potilailla, joilla on krooninen SCI-rakko. Virtsarakon tulehdus ja toimintahäiriö SCI-rakoissa voivat myös olla muuttavat sensoristen proteiinien ilmentymistä, kuten purinergisessä reseptorissa P2X3, ohimenevässä reseptoripotentiaalissa vallinoidireseptorialaperheessä 1, adenosiinitrifosfaatissa ja typpioksidissa. Uroteelin toimintahäiriö saattaa myös johtaa C-kuitujen lisääntyneeseen kiihtyneisyyteen, joista tulee pääasiassa virtsaamisrefleksin afferentteja hermoja SCI:n jälkeen. Ihmisillä, joilla on NDO, virtsarakon P2X2-, P2X3- ja muskariinireseptorien M2- ja M3-tasot alenivat detrusor-onabotulinumtoxinA-injektion jälkeen, mikä viittaa siihen, että tämä toksiini estää DO:ta estämällä virtsaamisrefleksin sekä sensorisia että motorisia käsivarsia. Lisäksi β3-AR:iden tiedetään edistävän virtsan varastoitumista virtsarakkoon indusoimalla detrusorin rentoutumista eläinten ja ihmisten rakoissa. Ihmisillä β3-AR on vallitseva β-reseptorin alatyyppi virtsarakossa. Ei ole raportoitu β3-AR:n muutoksista SCI-virtsarakon uroteelissä ennen onabotulinumtoksiinihoitoa tai sen jälkeen.

OnabotulinumtoxinA-injektion jälkeen potilaat voivat olla oireettomia 3-6 kuukauden ajan ennen oireiden uusiutumista. Suurin osa onabotulinumtoxinA:ta koskevista NDO-tutkimuksista on peräisin eläinmalleista, ja vain muutamia ihmistutkimuksia on havaittu. Nykyisessä tutkimuksessa tutkittiin muutoksia uroteelin toimintahäiriössä ja sensoristen proteiinien ilmentymisessä virtsarakon uroteelissä ajan kuluessa yhden onabotuliinitoksiini-injektion jälkeen SCI-potilailla.

Materiaalit ja menetelmät

Yhteensä 26 potilasta, joilla oli krooninen SCI, joka aiheutti NDO:ta ja virtsankarkailua, hoidettiin yhdellä 200 U onabotulinumtoxinA:n injektiolla detrusor-lihakseen. Kaikilla potilailla oli virtsanpidätyskyvyttömyyttä, johon liittyi tai ei ollut vaikeaa virtsarakon tyhjennystä. Potilaille, jotka saivat detrusor-injektioita, ehdotettiin puhdasta jaksoittaista katetrointia mahdolliseksi virtsanhallintamenetelmäksi hoidon jälkeen. Buddhist Tzu Chi General Hospitalin Institutional Review Board ja Ethics Committee hyväksyi nykyisen tutkimuksen (IRB:098-53). Jokaiselle potilaalle kerrottiin tutkimuksen perusteista ja menettelyistä, ja kirjallinen tietoinen suostumus osallistumiseen hankittiin ennen mitään virtsarakon toimenpidettä.

Video urodynaamiset tutkimukset

Kaikki potilaat saivat videourodynaamisen tutkimuksen (VUDS) ennen ilmoittautumistaan. Virtsarakon ja virtsaputken toimintahäiriö luokiteltiin DO:n esiintymiseksi koordinoidulla tai dyssynergisellä virtsaputken sulkijalihaksen aktiivisuudella. Potilaat, joilla oli virtsatietulehdus, hoidettiin asianmukaisesti ennen kuin heille määrättiin onabotulinumtoxinA-injektio. VUDS-tulokset tulkittiin International Continence Societyn suositusten mukaisesti. VUDS-parametrit sisälsivät maksimivirtausnopeuden (Qmax), detrusorin tyhjennyspaineen Qmax:ssa (Pdet), rakon kystometrisen kapasiteetin (CBC), tyhjentyneen tilavuuden (Vol) ja tyhjennyksen jälkeisen jäännöstilavuuden (PVR).

OnabotulinumtoxinA-injektio

Kaikki potilaat saivat 200 U onabotulinumtoxinA:ta 20 ml:ssa normaalia suolaliuosta (BOTOX®, 100 U/pullo, Allergan Inc., Irvine, USA) leikkaussalissa jäykällä sytoskooppisella injektiolla (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Saksa) 40 injektioon virtsarakon seinämän kohtiin, säästäen trigonia. Injektion jälkeen virtsaputken Foley-katetri asetettiin rutiininomaisesti ja poistettiin seuraavana aamuna ennen kuin potilaat kotiutuivat. Laajakirjoisia antibiootteja määrättiin 3 vuorokaudeksi hoidon jälkeen.

OnabotulinumtoxinA-injektion jälkeen otettiin satunnaisesti neljä virtsarakon kylmäkuppibiopsiaa takaseinästä noin 2 cm virtsanvälisen harjanteen yläpuolella, ja vain virtsarakon limakalvo ja submukoosi otettiin virtsarakon perforaation estämiseksi; erytematoottista tai tulehduksellista virtsarakon limakalvoa vältettiin. Yksi virtsarakon biopsianäyte jokaisesta potilaasta lähetettiin patologian osastolle karsinooman mahdollisuuden poissulkemiseksi in situ. Loput kolme näytettä kustakin potilaasta säilytettiin optimaalisessa leikkauslämpötilassa ja nestetypessä muita immunohistokemiallisia tutkimuksia varten.

Potilaan seuranta ja tulosten arviointi

Potilaita seurattiin OPD:ssä kuukausittain, ja VUDS ja virtsarakon ja virtsaamistilan sekä hoitoon tyytyväisyyden arviointi suoritettiin 3 ja 6 kuukautta hoidon jälkeen. Jos CBC nousi 50 % perusarvosta, hoitotuloksen katsottiin onnistuneen; muuten tulos katsottiin epäonnistuneeksi tuolloin. Kontrollina toimi kymmenen naispotilasta, joilla oli stressiin liittyvä virtsankarkailu ilman toistuvaa kiireellistä tarvetta. VUDS vahvisti kaikilla kontrollipotilailla virtsarakon ulostulotukoksia tai DO:ta vapaiksi. Kontrollirakon kudos saatiin inkontinenssin vastaisen leikkauksen aikana ja sitä käsiteltiin samalla tavalla kuin SCI-potilaat. Miespotilaita ei valittu toimimaan kontrollina, koska eturauhanen saattoi aiheuttaa virtsarakon ulostulon tukkeutumisen ja vaikuttaa virtsarakon toimintaan.

Immunofluoresenssi

Virtsarakon kudosnäytteitä SCI-potilailta ja kontrolleilta tutkittiin uroteelin E-kadheriinin (tarttuva proteiini), ZO-1 (liitosproteiini) ja syöttösoluaktivaatio (tryptaasi) tasojen muutosten varalta immunofluoresenssilla; solujen apoptoosi tutkittiin terminaalisen deoksinukleotidyylitransferaasin dUTP-nick-pään leimausmäärityksellä. Nämä toimenpiteet suoritettiin samalla tavalla kuin edellisessä tutkimuksessamme 6 μm:n paksuisilla kudosleikkeillä. Virtsarakkonäytteet upotettiin ja kiinnitettiin 1 tunnin ajan jääkylmään 4-prosenttiseen formaldehydiin fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (pH 7,4), sitten huuhdeltiin jääkylmällä fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella, joka sisälsi 15 % sakkaroosia 12 tunnin ajan. Biopsianäytteet upotettiin optimaalisen leikkauslämpötilan väliaineeseen ja säilytettiin -80 °C:ssa. Neljä leikettä näytettä kohti leikattiin kryostaattia käyttäen 8 μm:n paksuudella ja kerättiin uusille silaani III:lla päällystetyille lasilevyille (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokio, Japani). Leikkeet jälkifiksoitiin asetonissa -20 °C:ssa ja blokattiin kanin seerumilla. Leikkeitä inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa antihumaanisten E-kadheriinin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) tai tryptaasin (Chemicon, Temecula, CA, USA) primaaristen vasta-aineiden kanssa. Kun leikkeet oli huuhdeltu 0,1 % Tween-20:lla BPS:ssä, kanin anti-hiirikonjugoituja fluoreseiini-isotiosyanaattivasta-aineita (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Tanska) levitettiin ja inkuboitiin leikkeillä 1 tunti. Lopuksi leikkeet vastavärjättiin 4',6-diamidino-2-fenyyli-indolilla (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Negatiiviset kontrollit sisälsivät primaarisen vasta-aineen isotyypin. Saimme värjäytymisintensiteetin ja prosentuaalisen positiivisen alueen mittausten keskiarvon, maksimin, alueen ja keskihajonnan käyttämällä kolmea satunnaista kuumapistettä kussakin näytteessä.

Immunofluoresenssin kvantifiointi määritettiin neljässä peräkkäisessä suuritehoisessa kentässä (400X) alueella, jolla on suurin tiheys. Immunofluoresenssimääritykset (tryptaasi ja terminaalinen deoksinukleotidyylitransferaasi dUTP nick-pään leimaus) kvantifioitiin laskemalla positiivisesti värjäytyneiden solujen lukumäärä pinta-alayksikköä (4 μm2) kohti, ja ne esitetään prosentteina. E-kadheriinin (fluoresenssimikroskopia) ja ZO-1:n (konfokaalimikroskopia) fluoresenssin intensiteetti määritettiin käyttämällä kuvaa J.

Western blottausta käytettiin aistiproteiinien tasojen arvioimiseen virtsarakon limakalvonäytteissä. Primaarisia vasta-aineita olivat GeneTexin P2X3 (1:2000), endoteelin typpioksidisyntaasi [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) ja GAPDH (1:100000; sisäinen kontrolli). Irvine, CA, USA); indusoituva NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); ja p3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, UK). Aasin antigoat (β3-AR) tai vuohen antikanin (kaikki muut proteiinit) IgG-piparjuuriperoksidaasi (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) sekundäärisiä vasta-aineita käytettiin. Skannattu kalvo geelielektroforeesin jälkeen kvantifioitiin käyttämällä geelidokumentaatiojärjestelmää (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Iso-Britannia). Toimenpiteet olivat samanlaisia ​​kuin edellisessä tutkimuksessamme kuvatut.

Tilastollinen analyysi

Jatkuvat muuttujat esitettiin keskiarvoina ± keskihajonnat ja kategoriset tiedot numeroina ja prosentteina. Tukikelpoiset SCI-potilaat ryhmiteltiin hoitotuloksen mukaan ja verrattiin kontrolleihin. Erot funktionaalisten proteiinien tasoissa uroteelissä lähtötilanteessa ja 3 ja 6 kuukautta onabotulinumtoxinA-injektion jälkeen analysoitiin käyttämällä Studentin t-testiä. Erot immunofluoresenssissa ja sensoristen proteiinien Western blotissa onnistuneiden ja epäonnistuneiden hoitoryhmien välillä analysoitiin Kruskal-Wallis-testillä. Uroteelisten sensoristen proteiinien roolin selvittämiseksi NDO:ssa suoritettiin myös korrelaatioanalyysi lineaarista regressiota käyttäen, mukaan lukien VUDS- ja uroteelin toimintahäiriöparametrit. Kaikki laskelmat suoritettiin käyttämällä SPSS for Windows 16.0 -versiota (SPSS, Chicago, IL, USA). Erot katsottiin tilastollisesti merkitseviksi, jos P-arvot olivat alle 0,05.