Wpływ toksyny botulinowej typu A na neurogenną nadaktywność wypieracza u pacjentów z przewlekłym uszkodzeniem rdzenia kręgowego

W ostatnich dziesięcioleciach leczenie neurogennej nadaktywności wypieracza (NDO) toksyną botulinową A stało się alternatywną metodą leczenia powikłań urologicznych spowodowanych urazem rdzenia kręgowego (SCI) lub stwardnieniem rozsianym. Wstrzyknięcie 200-300 j. toksyny botulinowej A do mięśnia wypieracza może zmniejszyć kurczliwość, poprawić podatność pęcherza i przywrócić trzymanie moczu u pacjentów z NDO. Jednak niedoczynność wypieracza rozwinie się po wstrzyknięciu 300 j. onabotulinumtoxinA, a poprawa parametrów urodynamicznych i jakości życia trwała 9 miesięcy. Obecnie jako standardowe leczenie NDO zaleca się pojedyncze wstrzyknięcie 200 j. toksyny botulinowej A do wypieracza. Jednak terapeutyczny czas trwania tej dawki na NDO był krótszy niż w przypadku wstrzyknięcia 300 U.

OnabotulinumtoxinA skutecznie łagodzi objawy ze strony dolnych dróg moczowych poprzez hamowanie transmisji sygnału w połączeniach nerwowo-mięśniowych i nerwowo-gruczołowych. OnabotulinumtoxinA rozszczepia białko 25 związane z synaptosomem i hamuje przekazywanie sygnału poprzez zakłócanie fuzji pęcherzyków zawierających neuroprzekaźnik ze ścianą neuronu. W pęcherzu moczowym uwalnianie acetylocholiny zarówno z przed-, jak i zazwojowych nerwów przywspółczulnych jest blokowane po podaniu onabotulinumtoxinA. Stwierdzono również, że toksyna ta moduluje aferentną aktywność pęcherza moczowego związaną ze zmniejszonym parciem na mocz i objawami nietrzymania moczu z parciem u pacjentów z NDO. Chociaż wpływ onabotulinumtoxinA na współczulny układ nerwowy w obrębie pęcherza moczowego jest niejasny, wywiera ona hamujący wpływ na uwalnianie noradrenaliny do receptorów α- i β3-adrenergicznych (β3-AR), które regulują odpowiednio skurcz szyi pęcherza moczowego i relaksację wypieracza pęcherza moczowego.

W poprzednim badaniu odnotowano odpowiednio zmniejszoną ekspresję białek adhezyjnych i łączących E-kadherynę i zonula occludens-1 (ZO-1) oraz zwiększone zapalenie podbłonkowe z apoptozą u pacjentów z przewlekłymi pęcherzami SCI. Zapalenie i dysfunkcja nabłonka dróg moczowych w pęcherzach SCI może również zmieniać ekspresję białek czuciowych, takich jak receptor purynergiczny P2X3, podrodzina 1 receptora przejściowego potencjalnego receptora wallinoidowego, trójfosforan adenozyny i tlenek azotu. Dysfunkcja nabłonka dróg moczowych może również skutkować zwiększoną pobudliwością włókien C, które stają się głównie nerwami doprowadzającymi odruchu mikcji po SCI. U ludzi z NDO poziom receptorów P2X2, P2X3 i muskarynowych M2 i M3 w pęcherzu był zmniejszony po wstrzyknięciu toksyny botulinowej A wypieracza, co sugeruje, że toksyna ta hamuje DO poprzez hamowanie zarówno czuciowych, jak i motorycznych ramion odruchu mikcji. Ponadto wiadomo, że β3-AR sprzyjają magazynowaniu moczu w pęcherzu przez wywoływanie relaksacji wypieracza w pęcherzach zwierzęcych i ludzkich. U ludzi β3-AR jest dominującym podtypem receptora β w pęcherzu moczowym. Nie było doniesień o zmianach β3-AR w nabłonku pęcherza moczowego SCI przed lub po leczeniu toksyną botulinową.

Po wstrzyknięciu onabotulinumtoxinA pacjenci mogą być bezobjawowi przez okres 3-6 miesięcy przed nawrotem objawów. Większość badań onabotulinumtoxinA na NDO pochodzi z modeli zwierzęcych i odnotowano tylko kilka badań na ludziach. Obecne badanie dotyczyło zmian w dysfunkcji nabłonka dróg moczowych i ekspresji białek czuciowych w nabłonku pęcherza moczowego w czasie po pojedynczym wstrzyknięciu toksyny botulinowej pacjentom z SCI.

Materiały i metody

W sumie 26 pacjentów z przewlekłym SCI powodującym NDO i nietrzymaniem moczu leczono pojedynczym wstrzyknięciem 200 U onabotulinumtoxinA do mięśnia wypieracza. Wszyscy pacjenci zgłaszali się z nietrzymaniem moczu z lub bez trudności w opróżnianiu pęcherza. U pacjentów, którzy otrzymali zastrzyki z wypieracza, sugerowano czyste przerywane cewnikowanie jako możliwy sposób postępowania z moczem po leczeniu. Bieżące badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Radę Rewizyjną i Komisję Etyki Szpitala Ogólnego Buddyjskiego Tzu Chi (IRB:098-53). Każdy pacjent został poinformowany o przesłankach i procedurach badania, a pisemną świadomą zgodę na udział w badaniu uzyskano przed jakimkolwiek zabiegiem pęcherza moczowego.

Wideobadania urodynamiczne

Wszyscy pacjenci otrzymali badanie urodynamiczne wideo (VUDS) przed włączeniem do badania. Dysfunkcję pęcherza moczowego i cewki moczowej sklasyfikowano jako obecność DO ze skoordynowaną lub dyssynergiczną czynnością zwieracza cewki moczowej. Pacjenci z zakażeniem dróg moczowych byli odpowiednio leczeni przed zaplanowaniem wstrzyknięcia onabotulinumtoxinA. Wyniki VUDS interpretowano zgodnie z zaleceniami International Continence Society. Parametry VUDS obejmowały maksymalne natężenie przepływu (Qmax), ciśnienie mikcji wypieracza przy Qmax (Pdet), cystometryczną pojemność pęcherza (CBC), objętość mikcji (Vol) i objętość zalegającą po mikcji (PVR).

Wstrzyknięcie onabotulinumtoxinA

Wszyscy pacjenci otrzymali 200 j. toksyny botulinowej A w 20 ml soli fizjologicznej (BOTOX®, 100 j./fiolkę, Allergan Inc., Irvine, USA) na sali operacyjnej przez sztywną cytoskopową iniekcję (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Niemcy) do 40 j. miejsca na ścianie pęcherza, oszczędzając trójkąt Po wstrzyknięciu cewnik Foleya cewnik był rutynowo wprowadzany i usuwany następnego ranka przed wypisaniem pacjentów. Antybiotyki o szerokim spektrum działania zostały przepisane na 3 dni po leczeniu.

Po wstrzyknięciu toksyny botulinowej A, pobrano losowo cztery biopsje pęcherza metodą zimnego kubka z tylnej ściany około 2 cm powyżej grzbietu międzymoczowodowego i pobrano tylko błonę śluzową pęcherza i warstwę podśluzową, aby zapobiec perforacji pęcherza; uniknięto jakiejkolwiek rumieniowej lub zapalnej błony śluzowej pęcherza moczowego. Jedna próbka biopsji pęcherza moczowego od każdego pacjenta została wysłana do oddziału patologii, aby wykluczyć możliwość raka in situ. Pozostałe trzy próbki od każdego pacjenta przechowywano w optymalnej temperaturze cięcia iw ciekłym azocie do dalszych badań immunohistochemicznych.

Obserwacja pacjenta i ocena wyników

Pacjentów obserwowano co miesiąc w OPD, a VUDS oraz ocenę stanu pęcherza moczowego i mikcji oraz zadowolenia z leczenia wykonywano 3 i 6 miesięcy po leczeniu. Jeśli CBC zwiększyło się o 50% w stosunku do wartości wyjściowej, wynik leczenia uznano za pomyślny; w przeciwnym razie wynik uznano za niepowodzenie w tym punkcie czasowym. Dziesięć pacjentek z nietrzymaniem moczu związanym ze stresem bez częstego parcia na mocz służyło jako grupa kontrolna. U wszystkich pacjentów z grupy kontrolnej potwierdzono brak niedrożności ujścia pęcherza lub DO za pomocą VUDS. Kontrolną tkankę pęcherza uzyskano podczas operacji przeciw nietrzymaniu moczu i przetworzono tak samo, jak u pacjentów z SCI. Pacjentów płci męskiej nie wybrano jako grupy kontrolnej, ponieważ prostata może powodować niedrożność ujścia pęcherza moczowego i wpływać na czynność nabłonka dróg moczowych.

Immunofluorescencja

Próbki tkanki pęcherza moczowego od pacjentów z SCI i kontroli badano pod kątem zmian w poziomach E-kadheryny urotelialnej (białko adhezyjne), ZO-1 (białko łączące) i aktywacja komórek tucznych (tryptaza) za pomocą immunofluorescencji; apoptozę komórkową badano za pomocą końcowego testu znakowania nacięć końcowych transferazą dezoksynukleotydylową dUTP. Procedury te przeprowadzono podobnie jak w naszym poprzednim badaniu, z skrawkami tkanki o grubości 6 μm. Próbki pęcherza moczowego zanurzono i utrwalono na 1 godzinę w lodowatym 4% formaldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (pH 7,4), a następnie przepłukano lodowatą solą fizjologiczną buforowaną fosforanem zawierającą 15% sacharozę przez 12 godzin. Próbki z biopsji zatapiano w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia i przechowywano w temperaturze -80°C. Cztery skrawki na próbkę wycięto za pomocą kriostatu o grubości 8 μm i zebrano na nowych szklanych szkiełkach pokrytych silanem III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokio, Japonia). Skrawki utrwalono w acetonie w temperaturze -20°C i zablokowano króliczą surowicą. Skrawki inkubowano przez noc w 4 ° C z pierwotnymi przeciwciałami przeciw ludzkiej E-kadherynie (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) lub tryptazie (Chemicon, Temecula, CA, USA). Po przepłukaniu skrawków 0,1% Tween-20 w BPS, na skrawki nanoszono przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z antymysim izotiocyjanianem fluoresceiny (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Dania) i inkubowano na skrawkach przez 1 godzinę. Na koniec skrawki barwiono kontrastowo 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Kontrole negatywne obejmowały izotyp przeciwciała pierwszorzędowego. Otrzymaliśmy średnią, maksimum, zakres i odchylenie standardowe intensywności barwienia i procentowych pomiarów powierzchni dodatnich przy użyciu trzech losowych gorących punktów w każdej próbce.

Oznaczenie ilościowe immunofluorescencji określono w czterech kolejnych polach o dużej mocy (400X) w obszarze o największej gęstości. Testy immunofluorescencyjne (znakowanie końca nacięcia tryptazą i terminalną transferazą deoksynukleotydową dUTP) określono ilościowo przez zliczenie liczby dodatnio wybarwionych komórek na jednostkę powierzchni (4 μm2) i przedstawiono w procentach. Intensywność fluorescencji E-kadheryny (mikroskopia fluorescencyjna) i ZO-1 (mikroskopia konfokalna) określono ilościowo za pomocą Obrazu J.

Do oceny poziomu białek czuciowych w próbkach błony śluzowej pęcherza zastosowano metodę Western blotting. Pierwotne przeciwciała obejmowały P2X3 (1:2000), śródbłonkową syntazę tlenku azotu [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) i GAPDH (1:100000; kontrola wewnętrzna) z GeneTex ( Irvine, Kalifornia, USA); indukowalny NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); i β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Wielka Brytania). Zastosowano drugorzędowe przeciwciała oślego antykoziego (dla β3-AR) lub koziego antykróliczego (dla wszystkich innych białek) IgG-peroksydazy chrzanowej (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Zeskanowany film po elektroforezie żelowej oceniono ilościowo przy użyciu systemu dokumentacji żelowej (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Wielka Brytania). Procedury były podobne do opisanych w naszym poprzednim badaniu.

Analiza statystyczna

Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnie ± odchylenia standardowe, a dane kategoryczne jako liczby i procenty. Kwalifikujący się pacjenci z SCI zostali pogrupowani zgodnie z wynikiem leczenia i porównani z grupą kontrolną. Różnice w poziomie białek funkcjonalnych w nabłonku dróg moczowych na początku badania oraz 3 i 6 miesięcy po wstrzyknięciu onabotulinumtoxinA analizowano za pomocą sparowanego testu t-Studenta. Różnice w immunofluorescencji i Western blot białek czuciowych między grupami, które odniosły sukces i nie powiodły się, analizowano za pomocą testu Kruskala-Wallisa. W celu wyjaśnienia roli białek czuciowych nabłonka dróg moczowych w NDO przeprowadzono również analizę korelacji za pomocą regresji liniowej, w tym parametry VUDS i dysfunkcji nabłonka dróg moczowych. Wszystkie obliczenia wykonano przy użyciu SPSS dla Windows w wersji 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Różnice uznano za statystycznie istotne, jeśli wartości P były mniejsze niż 0,05.