Effekt av botulinumtoxin A på neurogen detrusoröveraktivitet hos patienter med kronisk ryggmärgsskada

Under de senaste decennierna har behandling av neurogen detrusoröveraktivitet (NDO) med onabotulinumtoxinA dykt upp som en alternativ metod för hantering av urologiska komplikationer på grund av ryggmärgsskada (SCI) eller multipel skleros. Injektion av 200-300 E av onabotulinumtoxinA i detrusormuskeln kan minska kontraktiliteten, förbättra urinblåsan och återställa urinkontinens hos patienter med NDO. Detrusorunderaktivitet kommer dock att utvecklas efter injektion av 300 U onabotulinumtoxinA och förbättring av urodynamiska och livskvalitetsparametrar varade i 9 månader. För närvarande har en 200 U enkel injektion av onabotulinumtoxinA i detrusorn rekommenderats som standardbehandling för NDO. Den terapeutiska varaktigheten av denna dos på NDO var dock kortare än för en 300 U-injektion.

OnabotulinumtoxinA förbättrar effektivt symtomen i de nedre urinvägarna genom att hämma signalöverföringen vid de neuromuskulära och neuroglandulära korsningarna. OnabotulinumtoxinA klyver synaptosomassocierat protein 25 och hämmar signalöverföring genom att störa fusion av neurotransmittorinnehållande vesiklar med neuronväggen. I urinblåsan blockeras frisättningen av acetylkolin från både pre- och postganglioniska parasympatiska nerver efter administrering av onabotulinumtoxinA. Detta toxin visade sig också modulera den afferenta aktiviteten i urinblåsan i samband med minskad brådskande och brådskande urininkontinenssymptom hos NDO-patienter. Även om effekten av onabotulinumtoxinA på det sympatiska nervsystemet i urinblåsan är oklar, har det en hämmande effekt på frisättning av noradrenalin till α- och β3-adrenoreceptorer (β3-ARs) som reglerar blåshalskontraktion respektive detrusoravslappning.

En tidigare studie rapporterade minskat uttryck av adhesions- och korsningsproteinerna E-cadherin respektive zonula occludens-1 (ZO-1), och ökad suburotelial inflammation med apoptos hos patienter med kroniska SCI-blåsor. Uroteliala inflammation och dysfunktion i SCI-blåsor kan också förändra sensoriskt proteinuttryck, såsom i purinergisk receptor P2X3, transient receptorpotentiell vallinoidreceptorunderfamilj 1, adenosintrifosfat och kväveoxid. Urothelial dysfunktion kan också resultera i ökad excitabilitet hos C-fibrerna, som till övervägande del blir afferenta nerver i miktionsreflexen efter SCI. Hos människor med NDO reducerades nivåerna av blåsan P2X2, P2X3 och muskarinreceptorerna M2 och M3 efter detrusor onabotulinumtoxinA-injektion, vilket tyder på att detta toxin hämmar DO genom att hämma både de sensoriska och motoriska armarna av miktionsreflexen. Dessutom är β3-AR kända för att främja urinlagring i urinblåsan genom att inducera detrusoravslappning i blåsor från djur och människor. Hos människor är β3-AR den dominerande β-receptorsubtypen i urinblåsan. Det har inte funnits några rapporter om β3-AR-förändringar i SCI-urotel i urinblåsan före eller efter behandling med onabotulinumtoxin.

Efter onabotulinumtoxinA-injektion kan patienter vara symtomfria under en period av 3-6 månader innan symtomen återkommer. De flesta studier av onabotulinumtoxinA på NDO kommer från djurmodeller, och endast ett fåtal humanstudier har noterats. Den aktuella studien undersökte förändringar i urotelial dysfunktion och sensoriskt proteinuttryck i urinblåsan med tiden efter en enda onabotulinumtoxininjektion hos SCI-patienter.

Material och metoder

Totalt 26 patienter med kronisk SCI som orsakar NDO och urininkontinens behandlades med en enda injektion av 200 U onabotulinumtoxinA i detrusormuskeln. Alla patienter uppvisade urininkontinens med eller utan svår blåstömning. Hos patienter som fick detrusorinjektioner föreslogs ren intermittent kateterisering som ett möjligt sätt att hantera urinvägarna efter behandling. Den aktuella studien godkändes av den institutionella granskningsnämnden och etikkommittén på Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Varje patient informerades om studiens logik och procedurer, och skriftligt informerat samtycke till deltagande erhölls före varje blåsingrepp.

Video urodynamiska studier

Alla patienter fick en videourodynamisk studie (VUDS) innan de registrerades. Dysfunktion i urinblåsan och urinröret klassificerades som närvaron av DO med koordinerad eller dyssynergisk urinrörssfinkteraktivitet. Patienter med urinvägsinfektion behandlades ordentligt innan de var planerade för onabotulinumtoxinA-injektion. VUDS-resultaten tolkades enligt rekommendationerna från International Continence Society. VUDS-parametrar inkluderade maximal flödeshastighet (Qmax), detrusor tömningstryck vid Qmax (Pdet), cystometrisk blåskapacitet (CBC), tömd volym (Vol) och post-void residual (PVR) volym.

OnabotulinumtoxinA-injektion

Alla patienter fick 200 E av onabotulinumtoxinA i 20 mL normal koksaltlösning (BOTOX®, 100 E/flaska, Allergan Inc., Irvine, USA) i operationsrummet genom stel cytoskopisk injektion (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Tyskland) i 40 platser i blåsväggen, skonade trigonen. Efter injektionen infördes rutinmässigt en Foley-kateter från urinröret och avlägsnades nästa morgon innan patienterna skrevs ut. Bredspektrumantibiotika ordinerades under 3 dagar efter behandling.

Efter onabotulinumtoxinA-injektion togs fyra blåskallbiopsier slumpmässigt vid den bakre väggen ca 2 cm ovanför den interureteriska åsen, och endast blåsslemhinnan och submukosan togs för att förhindra perforering av urinblåsan; någon erytematös eller inflammatorisk blåslemhinna undveks. Ett blåsbiopsiprov från varje patient skickades till patologiavdelningen för att utesluta risken för karcinom in situ. De återstående tre proverna från varje patient förvarades vid optimal skärtemperatur och i flytande kväve för ytterligare immunhistokemistudier.

Patientuppföljning och resultatbedömning

Patienterna följdes upp vid OPD varje månad, och VUDS och bedömning av blås- och tömningstillstånd och tillfredsställelse med behandlingen utfördes 3 och 6 månader efter behandlingen. Om CBC ökade med 50 % från baslinjevärdet ansågs behandlingsresultatet vara framgångsrikt; annars ansågs resultatet vara ett misslyckande vid den tidpunkten. Tio kvinnliga patienter med stressrelaterad urininkontinens utan frekvent brådska fungerade som kontroller. Alla kontrollpatienter bekräftades fria från obstruktion av blåsutloppet eller DO av VUDS. Kontrollblåsvävnad erhölls under antiinkontinenskirurgi och bearbetades på samma sätt som SCI-patienter. Manliga patienter valdes inte ut att fungera som kontroller eftersom prostatan kunde orsaka obstruktion av blåsutloppet och påverka urotelfunktionen.

Immunfluorescens

Blåsvävnadsprover från SCI-patienter och kontroller undersöktes med avseende på förändringar i urotelial E-cadherin (adhesivt protein), ZO-1 (junction protein) och mastcellsaktivering (tryptas) nivåer genom immunfluorescens; cellulär apoptos undersöktes genom terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick-ändmärkningsanalys. Dessa procedurer utfördes liknande de i vår tidigare studie, med 6-μm tjocka vävnadssnitt. Urinblåsprover nedsänktes och fixerades under 1 timme i iskall 4 % formaldehyd i fosfatbuffrad saltlösning (pH 7,4) och sköljdes sedan med iskall fosfatbuffrad saltlösning innehållande 15 % sackaros i 12 timmar. Biopsiprover bäddades in i medium med optimal skärtemperatur och förvarades vid -80 °C. Fyra sektioner per prov skars med en kryostat med en tjocklek av 8 μm och samlades upp på nya silan III-belagda glasskivor (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan). Sektioner efterfixerades i aceton vid -20°C och blockerades med kaninserum. Sektionerna inkuberades över natten vid 4 ° C med antihumant E-cadherin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) eller tryptas (Chemicon, Temecula, CA, USA) primära antikroppar. Efter sköljning av sektionerna med 0,1 % Tween-20 i BPS, applicerades kanin-antimus-konjugerade fluorescein-isotiocyanat-sekundära antikroppar (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Danmark) och inkuberades på sektioner i 1 timme. Slutligen motfärgades sektioner med 4',6-diamidino-2-fenylindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Negativa kontroller inkluderade isotypen av den primära antikroppen. Vi erhöll medelvärdet, maximum, intervallet och standardavvikelsen för färgningsintensiteten och procentuell positiv areamätning med hjälp av tre slumpmässiga hot spots inom varje prov.

Immunfluorescenskvantifiering bestämdes i fyra på varandra följande högeffektfält (400X) i området med den största densiteten. Immunfluorescensanalyser (tryptas och terminal deoxinukleotidyltransferas dUTP nick-ändmärkning) kvantifierades genom att räkna antalet positivt färgade celler per ytenhet (4 μm2) och visas i procent. Intensiteten av E-cadherin (fluorescensmikroskopi) och ZO-1 (konfokalmikroskopi) fluorescens kvantifierades med hjälp av bild J.

Western blotting användes för att bedöma nivåerna av sensoriska proteiner i prover från urinslemhinnan. Primära antikroppar inkluderade P2X3 (1:2000), endotelial kväveoxidsyntas [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) och GAPDH (1:100000; intern kontroll) från GeneTex ( Irvine, CA, USA); inducerbar NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); och P3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Storbritannien). Åsna-antiget (för β3-AR) eller get-antikanin (för alla andra proteiner) IgG-pepparrotsperoxidas (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) användes sekundära antikroppar. Den skannade filmen efter gelelektrofores kvantifierades med hjälp av ett geldokumentationssystem (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Storbritannien). Procedurerna liknade de som beskrevs i vår tidigare studie.

Statistisk analys

Kontinuerliga variabler presenterades som medelvärden ± standardavvikelser, och kategoriska data presenterades som siffror och procentsatser. Kvalificerade SCI-patienter grupperades efter behandlingsresultat och jämfördes med kontroller. Skillnader i nivåerna av funktionella proteiner i urotelet vid baslinjen och 3 och 6 månader efter onabotulinumtoxinA-injektion analyserades med hjälp av ett parat Students t-test. Skillnader i immunfluorescens och Western blot av sensoriska proteiner mellan framgångsrika och misslyckade behandlingsgrupper analyserades med Kruskal-Wallis-testet. För att klargöra rollerna för uroteliala sensoriska proteiner i NDO utfördes också korrelationsanalys med linjär regression, inklusive VUDS och urotelial dysfunktionsparametrar. Alla beräkningar gjordes med SPSS för Windows version 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Skillnader ansågs vara statistiskt signifikanta om P-värdena var mindre än 0,05.