Effekt af botulinumtoksin A på neurogen detrusor-overaktivitet hos kroniske rygmarvsskadede patienter

I de seneste årtier er behandling af neurogen detrusor-overaktivitet (NDO) med onabotulinumtoxinA dukket op som en alternativ metode til håndtering af urologiske komplikationer på grund af rygmarvsskade (SCI) eller multipel sklerose. Injektion af 200-300 U onabotulinumtoxinA i detrusormusklen kan reducere kontraktiliteten, forbedre blærecompliance og genoprette urinkontinens hos patienter med NDO. Imidlertid vil detrusorunderaktivitet udvikle sig efter injektion af 300 U onabotulinumtoxinA og forbedring af urodynamiske og livskvalitetsparametre varede 9 måneder. I øjeblikket er en 200 E enkelt injektion af onabotulinumtoxinA i detrusoren blevet anbefalet som standardbehandling for NDO. Imidlertid var den terapeutiske varighed af denne dosis på NDO kortere end for en 300 U-injektion.

OnabotulinumtoxinA forbedrer effektivt de nedre urinvejssymptomer ved at hæmme signaltransmissionen ved de neuromuskulære og neuroglandulære forbindelser. OnabotulinumtoxinA spalter synaptosom-associeret protein 25 og hæmmer signaltransmission ved at forstyrre fusion af neurotransmitterholdige vesikler med neuronvæggen. I urinblæren blokeres frigivelse af acetylcholin fra både præ- og postganglioniske parasympatiske nerver efter administration af onabotulinumtoxinA. Dette toksin viste sig også at modulere afferent aktivitet af blæren forbundet med reduceret hastende og hastende urininkontinenssymptomer hos NDO-patienter. Selvom virkningen af ​​onabotulinumtoxinA på det sympatiske nervesystem i urinblæren er uklar, har det en hæmmende effekt på frigivelse af noradrenalin til α- og β3-adrenoreceptorer (β3-AR'er), som regulerer henholdsvis blærehalskontraktion og detrusorafslapning.

En tidligere undersøgelse rapporterede nedsat ekspression af henholdsvis adhæsions- og forbindelsesproteinerne E-cadherin og zonula occludens-1 (ZO-1) og øget suburothelial inflammation med apoptose hos patienter med kroniske SCI blærer. Urothelial inflammation og dysfunktion i SCI blærer kan også ændre sensorisk proteinekspression, såsom i purinerg receptor P2X3, transient receptorpotentiel vallinoidreceptor underfamilie 1, adenosintrifosfat og nitrogenoxid. Urothelial dysfunktion kan også resultere i øget excitabilitet af C-fibrene, som overvejende bliver til afferente nerver af vandladningsrefleksen efter SCI. Hos mennesker med NDO blev niveauerne af blære P2X2, P2X3 og muskarine receptorer M2 og M3 reduceret efter detrusor onabotulinumtoxinA-injektion, hvilket tyder på, at dette toksin hæmmer DO ved at hæmme både de sensoriske og motoriske arme af vandladningsrefleksen. Derudover er β3-AR'er kendt for at fremme urinopbevaring i blæren ved at inducere detrusorafslapning i dyre- og menneskeblærer. Hos mennesker er β3-AR den dominerende β-receptor subtype i urinblæren. Der er ikke rapporteret om β3-AR-ændringer i SCI blæreurothelium før eller efter onabotulinumtoksinbehandling.

Efter onabotulinumtoxinA-injektion kan patienter være symptomfrie i en periode på 3-6 måneder, før symptomerne vender tilbage. De fleste undersøgelser af onabotulinumtoxinA på NDO stammer fra dyremodeller, og der er kun observeret få humane undersøgelser. Den nuværende undersøgelse undersøgte ændringer i urothelial dysfunktion og sensorisk proteinekspression i blærens urothelium med tiden efter en enkelt onabotulinumtoxin-injektion hos SCI-patienter.

Materialer og metoder

I alt 26 patienter med kronisk SCI, der forårsagede NDO og urininkontinens, blev behandlet med en enkelt injektion af 200 E onabotulinumtoxinA til detrusormusklen. Alle patienter præsenterede med urininkontinens med eller uden vanskelig blæretømning. Hos patienter, der modtog detrusor-injektioner, blev ren intermitterende kateterisering foreslået som en mulig måde at behandle urinen på efter behandling. Den aktuelle undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board og Ethics Committee of Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Hver patient blev informeret om undersøgelsens begrundelse og procedurer, og skriftligt informeret samtykke til deltagelse blev opnået før enhver blæreprocedure.

Video urodynamiske undersøgelser

Alle patienter modtog en video urodynamisk undersøgelse (VUDS) før deres indskrivning. Blære- og urethral dysfunktion blev klassificeret som tilstedeværelsen af ​​DO med koordineret eller dyssynerg urethral sphincter aktivitet. Patienter med urinvejsinfektion blev behandlet korrekt, før de blev planlagt til onabotulinumtoxinA-injektion. VUDS resultater blev fortolket i henhold til anbefalingerne fra International Continence Society. VUDS-parametre inkluderede maksimal flowhastighed (Qmax), detrusor-tømningstryk ved Qmax (Pdet), cystometrisk blærekapacitet (CBC), voidvolumen (Vol) og post-void-restvolumen (PVR).

OnabotulinumtoxinA-injektion

Alle patienter modtog 200 E onabotulinumtoxinA i 20 mL normalt saltvand (BOTOX®, 100 E/hætteglas, Allergan Inc., Irvine, USA) i operationsstuen ved stiv cytoskopisk injektion (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Tyskland) i 40 steder af blærevæggen, der skånede trigonen. Efter injektion blev et urethralt Foley-kateter rutinemæssigt indsat og fjernet næste morgen, før patienterne blev udskrevet. Bredspektret antibiotika blev ordineret i 3 dage efter behandlingen.

Efter onabotulinumtoxinA-injektion blev der tilfældigt taget fire blæres kold kop biopsier ved bagvæggen ca. 2 cm over den interureteriske højderyg, og kun blæreslimhinden og submucosaen blev taget for at forhindre blæreperforering; enhver erytematøs eller inflammatorisk blæreslimhinde blev undgået. En blærebiopsiprøve fra hver patient blev sendt til patologisk afdeling for at udelukke muligheden for carcinom in situ. De resterende tre prøver fra hver patient blev opbevaret ved optimal skæretemperatur og i flydende nitrogen til yderligere immunhistokemiske undersøgelser.

Patientopfølgning og resultatvurdering

Patienterne blev fulgt op ved OPD månedligt, og VUDS og vurdering af blære- og tømningstilstande og tilfredshed med behandlingen blev udført 3 og 6 måneder efter behandlingen. Hvis CBC steg med 50 % fra basislinjeværdien, blev behandlingsresultatet anset for at være vellykket; ellers blev resultatet betragtet som en fiasko på det tidspunkt. Ti kvindelige patienter med stressrelateret urininkontinens uden hyppigt hastende forløb fungerede som kontroller. Alle kontrolpatienter blev bekræftet fri for blæreudløbsobstruktion eller DO af VUDS. Kontrolblærevæv blev opnået under anti-inkontinenskirurgi og behandlet på samme måde som SCI-patienter. Mandlige patienter blev ikke udvalgt til at tjene som kontroller, fordi prostata kunne forårsage blæreudløbsobstruktion og påvirke urothelial funktion.

Immunfluorescens

Blærevævsprøver fra SCI-patienter og kontroller blev undersøgt for ændringer i urothelial E-cadherin (klæbende protein), ZO-1 (junction protein) og mastcelleaktivering (tryptase) niveauer ved immunfluorescens; cellulær apoptose blev undersøgt ved terminal deoxynukleotidyltransferase dUTP nick-endemærkningsassay. Disse procedurer blev udført svarende til dem i vores tidligere undersøgelse med 6-μm tykkelse vævssnit. Urinblæreprøver blev nedsænket og fikseret i 1 time i iskold 4 % formaldehyd i phosphatbufret saltvand (pH 7,4) og derefter skyllet med iskold phosphatbufret saltvand indeholdende 15 % saccharose i 12 timer. Biopsiprøver blev indlejret i medium med optimal skæretemperatur og opbevaret ved -80 °C. Fire sektioner pr. prøve blev skåret ved hjælp af en kryostat i en tykkelse på 8 μm og opsamlet på nye silan III-belagte objektglas (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan). Sektioner blev postfikseret i acetone ved -20 °C og blokeret med kaninserum. Sektionerne blev inkuberet natten over ved 4 °C med antihumant E-cadherin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) eller tryptase (Chemicon, Temecula, CA, USA) primære antistoffer. Efter skylning af sektionerne med 0,1 % Tween-20 i BPS, blev kanin-antimus-konjugerede fluorescein-isothiocyanat-sekundære antistoffer (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Danmark) påført og inkuberet på sektioner i 1 time. Til sidst blev sektioner modfarvet med 4',6-diamidino-2-phenylindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Negative kontroller inkluderede isotypen af ​​det primære antistof. Vi opnåede middelværdi, maksimum, område og standardafvigelse af farvningsintensiteten og procent positive arealmålinger ved brug af tre tilfældige hot spots inden for hver prøve.

Immunfluorescenskvantificering blev bestemt i fire på hinanden følgende højeffektfelter (400X) i området med den største tæthed. Immunofluorescens (tryptase og terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end-mærkning) assays blev kvantificeret ved at tælle antallet af positivt farvede celler pr. arealenhed (4 μm2) og er vist som procenter. Intensiteten af ​​E-cadherin (fluorescensmikroskopi) og ZO-1 (konfokal mikroskopi) fluorescens blev kvantificeret ved hjælp af Image J.

Western blotting blev brugt til at vurdere niveauerne af sensoriske proteiner i blæreslimhindeprøver. Primære antistoffer inkluderede P2X3 (1:2000), endotelnitrogenoxidsyntase [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) og GAPDH (1:100000; intern kontrol) fra GeneTex ( Irvine, CA, USA); inducerbar NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); og β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, UK). Æsel-antiged (for β3-AR) eller gede-antikanin (for alle andre proteiner) IgG-peberrodsperoxidase (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) blev anvendt sekundære antistoffer. Den scannede film efter gelelektroforese blev kvantificeret ved hjælp af et geldokumentationssystem (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Storbritannien). Procedurerne svarede til dem, der er beskrevet i vores tidligere undersøgelse.

Statistisk analyse

Kontinuerlige variabler blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelser, og kategoriske data blev præsenteret som tal og procenter. Kvalificerede SCI-patienter blev grupperet efter behandlingsresultat og sammenlignet med kontroller. Forskelle i niveauerne af funktionelle proteiner i urothelium ved baseline og 3 og 6 måneder efter onabotulinumtoxinA-injektion blev analyseret ved hjælp af en parret Student's t-test. Forskelle i immunfluorescens og Western blot af sensoriske proteiner mellem vellykkede og mislykkede behandlingsgrupper blev analyseret under anvendelse af Kruskal-Wallis-testen. For at afklare rollerne af urotheliale sensoriske proteiner i NDO blev korrelationsanalyse ved hjælp af lineær regression også udført, inklusive VUDS og urothelial dysfunktionsparametre. Alle beregninger blev udført med SPSS til Windows version 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Forskelle blev betragtet som statistisk signifikante, hvis P-værdier var mindre end 0,05.