Efecto de la toxina botulínica A sobre la hiperactividad del detrusor neurogénico en pacientes con lesión medular crónica

En las últimas décadas, el tratamiento de la hiperactividad del detrusor neurogénica (NDO) con onabotulinumtoxinA ha surgido como un método alternativo para el manejo de las complicaciones urológicas por lesión de la médula espinal (LME) o esclerosis múltiple. La inyección de 200-300 U de onabotulinumtoxinA en el músculo detrusor puede reducir la contractilidad, mejorar la distensibilidad de la vejiga y restaurar la continencia urinaria en pacientes con NDO. Sin embargo, se desarrollará hipoactividad del detrusor después de la inyección de 300 U de onabotulinumtoxinA y la mejora de los parámetros urodinámicos y de calidad de vida duró 9 meses. Actualmente, se recomienda una inyección única de 200 U de onabotulinumtoxinA en el detrusor como tratamiento estándar para NDO. Sin embargo, la duración terapéutica de esta dosis en NDO fue más corta que la de una inyección de 300 U.

La onabotulinumtoxinA mejora eficazmente los síntomas del tracto urinario inferior al inhibir la transmisión de señales en las uniones neuromusculares y neuroglandulares. La onabotulinumtoxinA escinde la proteína 25 asociada al sinaptosoma e inhibe la transmisión de señales al interrumpir la fusión de vesículas que contienen neurotransmisores con la pared neuronal. En la vejiga urinaria, la liberación de acetilcolina de los nervios parasimpáticos preganglionares y posganglionares se bloquea después de la administración de onabotulinumtoxinA. También se encontró que esta toxina modula la actividad aferente de la vejiga asociada con la reducción de los síntomas de urgencia e incontinencia urinaria de urgencia en pacientes con NDO. Aunque el impacto de la onabotulinumtoxinA en el sistema nervioso simpático dentro de la vejiga urinaria no está claro, tiene un efecto inhibitorio sobre la liberación de norepinefrina a los adrenorreceptores α y β3 (β3-AR) que regulan la contracción del cuello de la vejiga y la relajación del detrusor, respectivamente.

Un estudio anterior informó una disminución de la expresión de las proteínas de unión y adhesión E-cadherina y zonula occludens-1 (ZO-1), respectivamente, y un aumento de la inflamación suburotelial con apoptosis en pacientes con vejigas con LME crónica. La inflamación urotelial y la disfunción en las vejigas con LME también podrían alteran la expresión de proteínas sensoriales, como en el receptor purinérgico P2X3, la subfamilia 1 del receptor de vallinoide potencial del receptor transitorio, el trifosfato de adenosina y el óxido nítrico. La disfunción urotelial también puede resultar en una mayor excitabilidad de las fibras C que se vuelven predominantemente nervios aferentes del reflejo de la micción después de una SCI. En humanos con NDO, los niveles de P2X2, P2X3 y de los receptores muscarínicos M2 y M3 de la vejiga se redujeron después de la inyección de onabotulinumtoxinA A en el detrusor, lo que sugiere que esta toxina inhibe la DO al inhibir los brazos sensoriales y motores del reflejo de la micción. Además, se sabe que los RA-β3 promueven el almacenamiento de orina en la vejiga al inducir la relajación del detrusor en vejigas animales y humanas. En humanos, el RA-β3 es el subtipo de receptor β predominante en la vejiga urinaria. No ha habido informes sobre cambios en el RA-β3 en el urotelio de la vejiga SCI antes o después del tratamiento con onabotulinumtoxin.

Después de la inyección de onabotulinumtoxinA, los pacientes pueden estar libres de síntomas durante un período de 3 a 6 meses antes de que los síntomas recaigan. La mayoría de los estudios de onabotulinumtoxinA en NDO provienen de modelos animales y solo se han observado unos pocos estudios en humanos. El estudio actual investigó los cambios en la disfunción urotelial y la expresión de proteínas sensoriales en el urotelio de la vejiga con el tiempo después de una sola inyección de onabotulinumtoxin en pacientes con SCI.

Materiales y métodos

Un total de 26 pacientes con LME crónica que causaba NDO e incontinencia urinaria fueron tratados con una inyección única de 200 U de onabotulinumtoxinA en el músculo detrusor. Todos los pacientes presentaron incontinencia urinaria con o sin dificultad para vaciar la vejiga. En los pacientes que recibieron inyecciones en el detrusor, se sugirió el cateterismo intermitente limpio como un posible modo de manejo urinario después del tratamiento. El estudio actual fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional y el Comité de Ética del Hospital General Budista Tzu Chi (IRB:098-53). Se informó a cada paciente sobre la justificación y los procedimientos del estudio, y se obtuvo un consentimiento informado por escrito para participar antes de cualquier procedimiento de vejiga.

Estudios de videourodinamia

Todos los pacientes recibieron un estudio urodinámico de video (VUDS) antes de su inscripción. La disfunción vesical y uretral se clasificó como la presencia de DO con actividad coordinada o disinérgica del esfínter uretral. Los pacientes con infección del tracto urinario recibieron el tratamiento adecuado antes de programar la inyección de onabotulinumtoxinA. Los resultados de VUDS se interpretaron de acuerdo con las recomendaciones de la Sociedad Internacional de Continencia. Los parámetros de VUDS incluyeron el índice de flujo máximo (Qmax), la presión de vaciado del detrusor en Qmax (Pdet), la capacidad vesical cistométrica (CBC), el volumen vaciado (Vol) y el volumen residual posmiccional (PVR).

Inyección de onabotulinumtoxinA

Todos los pacientes recibieron 200 U de onabotulinumtoxinA en 20 mL de solución salina normal (BOTOX®, 100 U/vial, Allergan Inc., Irvine, EE. UU.) en el quirófano mediante inyección citoscópica rígida (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Alemania) en 40 sitios de la pared de la vejiga, respetando el trígono Después de la inyección, se insertó rutinariamente un catéter de Foley uretral y se retiró a la mañana siguiente antes de que los pacientes fueran dados de alta. Se prescribieron antibióticos de amplio espectro durante 3 días después del tratamiento.

Después de la inyección de onabotulinumtoxinA, se tomaron al azar cuatro biopsias vesicales en copa fría en la pared posterior, aproximadamente 2 cm por encima de la cresta interureteral, y solo se tomaron la mucosa y la submucosa de la vejiga para evitar la perforación vesical; se evitó cualquier mucosa vesical eritematosa o inflamatoria. Se envió una muestra de biopsia vesical de cada paciente al departamento de patología para descartar la posibilidad de carcinoma in situ. Las tres muestras restantes de cada paciente se almacenaron a la temperatura de corte óptima y en nitrógeno líquido para realizar más estudios de inmunohistoquímica.

Seguimiento del paciente y evaluación de resultados

Los pacientes fueron seguidos en OPD mensualmente, y se realizaron VUDS y la evaluación de las condiciones de la vejiga y la micción y la satisfacción con el tratamiento 3 y 6 meses después del tratamiento. Si el CBC aumentó en un 50 % desde el valor inicial, el resultado del tratamiento se consideró exitoso; de lo contrario, el resultado se consideró un fracaso en ese momento. Diez pacientes mujeres con incontinencia urinaria relacionada con el estrés sin urgencia frecuente sirvieron como controles. Todos los pacientes de control fueron confirmados libres de obstrucción de la salida de la vejiga o DO por VUDS. El tejido de la vejiga de control se obtuvo durante la cirugía contra la incontinencia y se procesó igual que los pacientes con SCI. No se seleccionaron pacientes masculinos para servir como controles porque la próstata podría causar obstrucción de la salida de la vejiga y afectar la función urotelial.

inmunofluorescencia

Se examinaron muestras de tejido de vejiga de pacientes con SCI y controles para detectar cambios en los niveles de activación de mastocitos (triptasa) y E-cadherina urotelial (proteína adhesiva), ZO-1 (proteína de unión) mediante inmunofluorescencia; la apoptosis celular se examinó mediante un ensayo de marcaje de extremos de mella con dUTP de desoxinucleotidil transferasa terminal. Estos procedimientos se realizaron de manera similar a los de nuestro estudio anterior, con secciones de tejido de 6 μm de espesor. Las muestras de vejiga urinaria se sumergieron y fijaron durante 1 h en formaldehído al 4% enfriado con hielo en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) y luego se enjuagaron con solución salina tamponada con fosfato helada que contenía sacarosa al 15% durante 12 h. Las muestras de biopsia se incluyeron en un medio de temperatura de corte óptimo y se almacenaron a -80 °C. Se cortaron cuatro secciones por espécimen usando un criostato con un espesor de 8 μm y se recolectaron en portaobjetos de vidrio recubiertos con silano III nuevos (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokio, Japón). Las secciones se posfijaron en acetona a -20 °C y se bloquearon con suero de conejo. Las secciones se incubaron durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios anti-cadherina E humana (BD Biosciences, San Jose, CA, EE. UU.) o triptasa (Chemicon, Temecula, CA, EE. UU.). Después de enjuagar las secciones con Tween-20 al 0,1% en BPS, se aplicaron anticuerpos secundarios de isotiocianato de fluoresceína conjugado anti-ratón de conejo (DakoCytomation Dinamarca A/S, Glostrup, Dinamarca) y se incubaron en las secciones durante 1 hora. Finalmente, las secciones se contrastaron con 4',6-diamidino-2-fenilindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE. UU.). Los controles negativos incluyeron el isotipo del anticuerpo primario. Obtuvimos la media, el máximo, el rango y la desviación estándar de la intensidad de la tinción y el porcentaje de mediciones del área positiva utilizando tres puntos calientes aleatorios dentro de cada muestra.

La cuantificación de inmunofluorescencia se determinó en cuatro campos consecutivos de alta potencia (400X) en la zona de mayor densidad. Los ensayos de inmunofluorescencia (triptasa y desoxinucleotidil transferasa terminal dUTP nick end-labeling) se cuantificaron contando el número de células teñidas positivamente por unidad de área (4 μm2) y se muestran como porcentajes. La intensidad de la fluorescencia de E-cadherina (microscopía de fluorescencia) y ZO-1 (microscopía confocal) se cuantificó utilizando la Imagen J.

Se utilizó transferencia Western para evaluar los niveles de proteínas sensoriales en muestras de mucosa vesical. Los anticuerpos primarios incluyeron P2X3 (1:2000), óxido nítrico sintasa endotelial [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) y GAPDH (1:100000; control interno) de GeneTex ( Irvine, CA, EE. UU.); NOS inducible [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, EE. UU.); y β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Se usaron anticuerpos secundarios IgG-peroxidasa de rábano picante (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EE. UU.) anti-cabra de burro (para β3-AR) o anti-conejo de cabra (para todas las demás proteínas). La película escaneada después de la electroforesis en gel se cuantificó usando un sistema de documentación de gel (Quantity One Version 4.6.2, Laboratorios Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, Reino Unido). Los procedimientos fueron similares a los descritos en nuestro estudio anterior.

Análisis estadístico

Las variables continuas se presentaron como medias ± desviaciones estándar y los datos categóricos se presentaron como números y porcentajes. Los pacientes con LME elegibles se agruparon según el resultado del tratamiento y se compararon con los controles. Las diferencias en los niveles de proteínas funcionales en el urotelio al inicio y 3 y 6 meses después de la inyección de onabotulinumtoxinA se analizaron utilizando una prueba t de Student pareada. Las diferencias en inmunofluorescencia y transferencia Western de proteínas sensoriales entre los grupos de tratamiento exitosos y fallidos se analizaron mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Para aclarar las funciones de las proteínas sensoriales uroteliales en la NDO, también se realizó un análisis de correlación mediante regresión lineal, incluidos los parámetros de disfunción urotelial y VUDS. Todos los cálculos se realizaron con SPSS para Windows versión 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EE. UU.). Las diferencias se consideraron estadísticamente significativas si los valores de p eran inferiores a 0,05.