Vliv botulotoxinu A na neurogenní hyperaktivitu detruzoru u pacientů s chronickým poraněním míchy

V posledních desetiletích se léčba neurogenní hyperaktivity detruzoru (NDO) onabotulinumtoxinem A objevila jako alternativní metoda pro zvládání urologických komplikací způsobených poraněním míchy (SCI) nebo roztroušenou sklerózou. Injekce 200-300 U onabotulinumtoxinuA do detruzoru může snížit kontraktilitu, zlepšit poddajnost močového měchýře a obnovit močovou kontinenci u pacientů s NDO. Po injekci 300 U onabotulinumtoxinu A se však rozvine nedostatečná aktivita detruzoru a zlepšení urodynamických parametrů a parametrů kvality života trvalo 9 měsíců. V současné době se jako standardní léčba NDO doporučuje jednorázová injekce 200 U onabotulinumtoxinuA do detruzoru. Terapeutická doba trvání této dávky na NDO však byla kratší než u injekce 300 U.

OnabotulinumtoxinA účinně zlepšuje symptomy dolních močových cest inhibicí přenosu signálu na neuromuskulárních a neuroglandulárních spojeních. OnabotulinumtoxinA štěpí protein 25 spojený se synaptosomem a inhibuje přenos signálu narušením fúze vezikul obsahujících neurotransmitery s neuronální stěnou. V močovém měchýři je po podání onabotulinumtoxinu A blokováno uvolňování acetylcholinu z pre- i postgangliových parasympatických nervů. Bylo také zjištěno, že tento toxin moduluje aferentní aktivitu močového měchýře spojenou se sníženou naléhavostí a symptomy urgentní močové inkontinence u pacientů s NDO. Ačkoli vliv onabotulinumtoxinu A na sympatický nervový systém v močovém měchýři není jasný, má inhibiční účinek na uvolňování norepinefrinu do α- a β3-adrenoreceptorů (β3-ARs), které regulují kontrakci hrdla močového měchýře a relaxaci detruzoru.

Předchozí studie uváděla sníženou expresi adhezních a junkčních proteinů E-cadherin a zonula occludens-1 (ZO-1), v tomto pořadí, a zvýšený suburoteliální zánět s apoptózou u pacientů s chronickým měchýřem SCI. Uroteliální zánět a dysfunkce v měchýři SCI mohou také změnit expresi senzorického proteinu, jako je purinergní receptor P2X3, podrodina 1 vallinoidního receptoru s potenciálem přechodného receptoru, adenosintrifosfát a oxid dusnatý. Uroteliální dysfunkce může také vést ke zvýšené excitabilitě C-vláken, která se po SCI stávají převážně aferentními nervy mikčního reflexu. U lidí s NDO byly hladiny P2X2, P2X3 a muskarinových receptorů M2 a M3 v močovém měchýři sníženy po injekci detruzoru onabotulinumtoxinA, což naznačuje, že tento toxin inhibuje DO inhibicí jak senzorických, tak motorických ramen mikčního reflexu. Kromě toho je známo, že p3-AR podporují ukládání moči v močovém měchýři tím, že indukují relaxaci detruzoru ve zvířecích a lidských močových měchýřích. U lidí je β3-AR převládajícím podtypem β-receptorů v močovém měchýři. Nebyly hlášeny žádné změny β3-AR v SCI urotelu močového měchýře před nebo po léčbě onabotulinumtoxinem.

Po injekci onabotulinumtoxinuA mohou být pacienti po dobu 3-6 měsíců bez příznaků, než dojde k relapsu příznaků. Většina studií onabotulinumtoxinu A na NDO pochází ze zvířecích modelů a bylo zaznamenáno pouze několik studií na lidech. Současná studie zkoumala změny v uroteliální dysfunkci a expresi senzorických proteinů v urotelu močového měchýře v čase po jedné injekci onabotulinumtoxinu u pacientů s SCI.

Materiály a metody

Celkem 26 pacientů s chronickým SCI způsobujícím NDO a močovou inkontinenci bylo léčeno jednou injekcí 200 U onabotulinumtoxinA do detruzoru. Všichni pacienti měli močovou inkontinenci s nebo bez obtížného vyprazdňování močového měchýře. U pacientů, kteří dostávali injekce detruzoru, byla navržena čistá intermitentní katetrizace jako možný způsob léčby moči po léčbě. Současná studie byla schválena Institutional Review Board a Ethic Committee of Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Každý pacient byl informován o zdůvodnění studie a postupech a před jakýmkoli výkonem močového měchýře byl získán písemný informovaný souhlas s účastí.

Video urodynamické studie

Všichni pacienti podstoupili před zařazením video urodynamickou studii (VUDS). Dysfunkce močového měchýře a uretry byly klasifikovány jako přítomnost DO s koordinovanou nebo dyssynergickou aktivitou uretrálního svěrače. Pacienti s infekcí močových cest byli řádně léčeni předtím, než jim byla naplánována injekce onabotulinumtoxinuA. Výsledky VUDS byly interpretovány podle doporučení International Continence Society. Parametry VUDS zahrnovaly maximální průtok (Qmax), mikční tlak detruzoru při Qmax (Pdet), cystometrickou kapacitu močového měchýře (CBC), vymočený objem (Vol) a postmikční reziduální objem (PVR).

Injekce onabotulinumtoxinuA

Všichni pacienti dostali 200 U onabotulinumtoxinA ve 20 ml normálního fyziologického roztoku (BOTOX®, 100 U/lahvička, Allergan Inc., Irvine, USA) na operačním sále rigidní cytoskopickou injekcí (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Německo) do 40 místa stěny močového měchýře, šetřící trigon. Po injekci byl uretrální Foleyův katétr rutinně zaveden a vyjmut následující ráno před propuštěním pacientů. Na 3 dny po léčbě byla předepsána širokospektrá antibiotika.

Po injekci onabotulinumtoxinu A byly náhodně odebrány čtyři biopsie močového měchýře pomocí studeného pohárku na zadní stěně asi 2 cm nad interureterickým hřebenem a byla odebrána pouze sliznice a submukóza močového měchýře, aby se zabránilo perforaci močového měchýře; bylo zabráněno jakékoli erytematózní nebo zánětlivé sliznici močového měchýře. Jeden vzorek biopsie močového měchýře od každého pacienta byl odeslán na patologické oddělení k vyloučení možnosti karcinomu in situ. Zbývající tři vzorky od každého pacienta byly skladovány při optimální teplotě řezání a v kapalném dusíku pro další imunohistochemické studie.

Sledování pacienta a hodnocení výsledků

Pacienti byli sledováni na OPD měsíčně a VUDS a hodnocení stavu močového měchýře a močení a spokojenosti s léčbou byly prováděny 3 a 6 měsíců po léčbě. Pokud se CBC zvýšil o 50 % od výchozí hodnoty, byl výsledek léčby považován za úspěšný; jinak byl výsledek v daném časovém bodě považován za selhání. Jako kontroly sloužilo deset pacientek se stresovou inkontinencí moči bez časté urgence. U všech kontrolních pacientů bylo potvrzeno, že nemají obstrukci vývodu močového měchýře nebo DO pomocí VUDS. Kontrolní tkáň močového měchýře byla získána během operace proti inkontinenci a zpracována stejně jako pacienti s SCI. Mužští pacienti nebyli vybráni jako kontrola, protože prostata by mohla způsobit obstrukci vývodu močového měchýře a ovlivnit uroteliální funkci.

Imunofluorescence

Vzorky tkáně močového měchýře od pacientů s SCI a kontrol byly vyšetřeny na změny v hladinách uroteliálního E-kadherinu (adhezivní protein), ZO-1 (junkční protein) a aktivace žírných buněk (tryptáza) imunofluorescencí; buněčná apoptóza byla zkoumána testem koncového značení terminální deoxynukleotidyltransferázou dUTP. Tyto postupy byly provedeny podobně jako v naší předchozí studii s řezy tkáně o tloušťce 6 μm. Vzorky močového měchýře byly ponořeny a fixovány po dobu 1 hodiny v ledově chladném 4% formaldehydu ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (pH 7,4) a poté propláchnuty ledově studeným fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem obsahujícím 15% sacharózu po dobu 12 hodin. Bioptické vzorky byly uloženy v médiu s optimální teplotou řezu a skladovány při -80 °C. Čtyři řezy na vzorek byly nařezány pomocí kryostatu o tloušťce 8 μm a shromážděny na nových skleněných podložních sklíčkách potažených silanem III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokio, Japonsko). Řezy byly postfixovány v acetonu při -20 °C a blokovány králičím sérem. Řezy byly inkubovány přes noc při 4 °C s primárními protilátkami proti lidskému E-cadherinu (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) nebo tryptáze (Chemicon, Temecula, CA, USA). Po opláchnutí řezů 0,1% Tween-20 v BPS byly aplikovány králičí antimyší konjugované fluorescein isothiokyanát sekundární protilátky (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Denmark) a inkubovány na řezech po dobu 1 hodiny. Nakonec byly řezy kontrastně obarveny 4',6-diamidino-2-fenylindolem (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Negativní kontroly zahrnovaly izotyp primární protilátky. Získali jsme průměr, maximum, rozsah a směrodatnou odchylku měření intenzity zbarvení a procenta pozitivních ploch pomocí tří náhodných horkých míst v každém vzorku.

Imunofluorescenční kvantifikace byla stanovena ve čtyřech po sobě jdoucích polích s vysokým výkonem (400X) v oblasti s největší hustotou. Imunofluorescenční testy (značení konce tryptázy a terminální deoxynukleotidyltransferázy dUTP nick) byly kvantifikovány spočítáním počtu pozitivně obarvených buněk na jednotku plochy (4 μm2) a jsou uvedeny jako procenta. Intenzita fluorescence E-cadherinu (fluorescenční mikroskopie) a ZO-1 (konfokální mikroskopie) byla kvantifikována pomocí Image J.

Western blotting byl použit k hodnocení hladin senzorických proteinů ve vzorcích sliznice močového měchýře. Primární protilátky zahrnovaly P2X3 (1:2000), endoteliální syntázu oxidu dusnatého [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) a GAPDH (1:100000; vnitřní kontrola) od GeneTex ( Irvine, CA, USA); indukovatelné NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); a p3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, UK). Byly použity sekundární protilátky oslí antikozí (pro β3-AR) nebo kozí antikráličí (pro všechny ostatní proteiny) IgG-křenová peroxidáza (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Naskenovaný film po gelové elektroforéze byl kvantifikován pomocí gelového dokumentačního systému (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Spojené království). Postupy byly podobné těm popsaným v naší předchozí studii.

Statistická analýza

Spojité proměnné byly prezentovány jako průměry ± standardní odchylky a kategorická data byla prezentována jako čísla a procenta. Vhodní pacienti s SCI byli seskupeni podle výsledku léčby a porovnáni s kontrolami. Rozdíly v hladinách funkčních proteinů v urotelu na začátku a 3 a 6 měsíců po injekci onabotulinumtoxinu A byly analyzovány pomocí párového Studentova t-testu. Rozdíly v imunofluorescenci a Western blotu senzorických proteinů mezi úspěšnými a neúspěšnými léčebnými skupinami byly analyzovány pomocí Kruskal-Wallisova testu. Za účelem objasnění role uroteliálních senzorických proteinů v NDO byla provedena také korelační analýza pomocí lineární regrese, včetně parametrů VUDS a uroteliální dysfunkce. Všechny výpočty byly provedeny pomocí SPSS pro Windows verze 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Rozdíly byly považovány za statisticky významné, pokud byly hodnoty P menší než 0,05.