Efeito da toxina botulínica A na hiperatividade neurogênica do detrusor em pacientes com lesão crônica da medula espinhal

Nas últimas décadas, o tratamento da hiperatividade neurogênica do detrusor (NDO) com onabotulinumtoxinA surgiu como um método alternativo para o tratamento de complicações urológicas devido a lesão medular (SCI) ou esclerose múltipla. A injeção de 200-300 U de onabotulinumtoxinA no músculo detrusor pode reduzir a contratilidade, melhorar a complacência da bexiga e restaurar a continência urinária em pacientes com NDO. No entanto, a hipoatividade do detrusor se desenvolverá após a injeção de 300 U de onabotulinumtoxinA e a melhora dos parâmetros urodinâmicos e da qualidade de vida durou 9 meses. Atualmente, uma injeção única de 200 U de onabotulinumtoxinA no detrusor tem sido recomendada como tratamento padrão para NDO. No entanto, a duração terapêutica desta dosagem em NDO foi menor do que a de uma injeção de 300 U.

A onabotulinumtoxinA melhora efetivamente os sintomas do trato urinário inferior, inibindo a transmissão do sinal nas junções neuromusculares e neuroglandulares. A onabotulinumtoxinA cliva a proteína 25 associada ao sinaptossoma e inibe a transmissão do sinal interrompendo a fusão das vesículas contendo neurotransmissores com a parede neuronal. Na bexiga urinária, a liberação de acetilcolina dos nervos parassimpáticos pré e pós-ganglionares é bloqueada após a administração de onabotulinumtoxinA. Verificou-se também que esta toxina modula a atividade aferente da bexiga associada à redução dos sintomas de urgência e incontinência urinária de urgência em pacientes com NDO. Embora o impacto da onabotulinumtoxinA no sistema nervoso simpático dentro da bexiga não seja claro, ela tem um efeito inibitório na liberação de norepinefrina para α e β3-adrenoceptores (β3-ARs) que regulam a contração do colo da bexiga e o relaxamento do detrusor, respectivamente.

Um estudo anterior relatou expressão diminuída das proteínas de adesão e junção E-caderina e zonula occludens-1 (ZO-1), respectivamente, e aumento da inflamação suburotelial com apoptose em pacientes com bexigas com LME crônica. A inflamação e disfunção uroteliais em bexigas com LME também podem alteram a expressão de proteínas sensoriais, como no receptor purinérgico P2X3, subfamília 1 do receptor vallinóide de potencial transitório, trifosfato de adenosina e óxido nítrico. A disfunção urotelial também pode resultar em aumento da excitabilidade das fibras C, que se tornam nervos predominantemente aferentes do reflexo de micção após a lesão medular. Em humanos com NDO, os níveis de bexiga P2X2, P2X3 e receptores muscarínicos M2 e M3 foram reduzidos após a injeção de onabotulinumtoxinA no detrusor, sugerindo que essa toxina inibe a DO ao inibir os braços sensoriais e motores do reflexo de micção. Além disso, os β3-ARs são conhecidos por promover o armazenamento de urina na bexiga por indução do relaxamento do detrusor em bexigas de animais e humanos. Em humanos, o β3-AR é o subtipo de receptor β predominante na bexiga urinária. Não houve relato de alterações de β3-AR no urotélio da bexiga com lesão medular antes ou após o tratamento com onabotulinumtoxin.

Após a injeção de onabotulinumtoxinA, os pacientes podem ficar assintomáticos por um período de 3 a 6 meses antes da recidiva dos sintomas. A maioria dos estudos de onabotulinumtoxinA em NDO vem de modelos animais, e apenas alguns estudos em humanos foram observados. O presente estudo investigou alterações na disfunção urotelial e na expressão de proteínas sensoriais no urotélio da bexiga com o tempo após uma única injeção de onabotulinumtoxin em pacientes com LME.

Materiais e métodos

Um total de 26 pacientes com LME crônica causando NDO e incontinência urinária foram tratados com uma única injeção de 200 U de onabotulinumtoxinA no músculo detrusor. Todos os pacientes apresentavam incontinência urinária com ou sem esvaziamento vesical difícil. Em pacientes que receberam injeções no detrusor, o cateterismo intermitente limpo foi sugerido como um possível modo de manejo urinário após o tratamento. O presente estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional e pelo Comitê de Ética do Hospital Geral Budista Tzu Chi (IRB:098-53). Cada paciente foi informado sobre a lógica e os procedimentos do estudo, e o consentimento informado por escrito para participar foi obtido antes de qualquer procedimento vesical.

Estudos urodinâmicos em vídeo

Todos os pacientes receberam um estudo urodinâmico de vídeo (SVUD) antes de sua inscrição. A disfunção vesical e uretral foi classificada como a presença de HD com atividade esfincteriana uretral coordenada ou dissinérgica. Os pacientes com infecção do trato urinário foram tratados adequadamente antes de serem agendados para injeção de onabotulinumtoxinA. Os resultados do VUDS foram interpretados de acordo com as recomendações da International Continence Society. Os parâmetros VUDS incluíram taxa de fluxo máximo (Qmax), pressão de micção do detrusor em Qmax (Pdet), capacidade cistométrica da bexiga (CBC), volume miccional (Vol) e volume residual pós-miccional (PVR).

Injeção de onabotulínica toxina A

Todos os pacientes receberam 200 U de onabotulínica toxina A em 20 mL de solução salina normal (BOTOX®, 100 U/frasco, Allergan Inc., Irvine, EUA) na sala de cirurgia por injeção citoscópica rígida (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Alemanha) em 40 locais da parede da bexiga, poupando o trígono. Após a injeção, um cateter uretral de Foley era rotineiramente inserido e removido na manhã seguinte, antes que os pacientes recebessem alta. Antibióticos de amplo espectro foram prescritos por 3 dias após o tratamento.

Após a injeção de onabotulinumtoxinA, quatro biópsias de bexiga fria foram feitas aleatoriamente na parede posterior cerca de 2 cm acima da crista interureteral, e apenas a mucosa e a submucosa da bexiga foram tiradas para evitar a perfuração da bexiga; qualquer mucosa vesical eritematosa ou inflamatória foi evitada. Uma amostra de biópsia da bexiga de cada paciente foi enviada ao departamento de patologia para excluir a possibilidade de carcinoma in situ. Os três espécimes restantes de cada paciente foram armazenados em temperatura ideal de corte e em nitrogênio líquido para estudos de imuno-histoquímica posteriores.

Acompanhamento do paciente e avaliação dos resultados

Os pacientes foram acompanhados no OPD mensalmente, e o VUDS e a avaliação das condições da bexiga e da micção e a satisfação com o tratamento foram realizados 3 e 6 meses após o tratamento. Se o hemograma aumentado em 50% em relação ao valor basal, o resultado do tratamento foi considerado bem-sucedido; caso contrário, o resultado foi considerado uma falha naquele momento. Dez pacientes do sexo feminino com incontinência urinária de esforço sem urgência frequente serviram como controle. Todos os pacientes de controle foram confirmados livres de obstrução da saída da bexiga ou DO por VUDS. O tecido da bexiga de controle foi obtido durante a cirurgia anti-incontinência e processado da mesma forma que os pacientes com LME. Pacientes do sexo masculino não foram selecionados para servir como controle porque a próstata pode causar obstrução da saída da bexiga e afetar a função urotelial.

imunofluorescência

Amostras de tecido da bexiga de pacientes com LME e controles foram examinadas quanto a alterações nos níveis de E-caderina urotelial (proteína adesiva), ZO-1 (proteína de junção) e ativação de mastócitos (triptase) por imunofluorescência; a apoptose celular foi examinada pelo ensaio de rotulagem terminal de desoxinucleotidil transferase dUTP. Esses procedimentos foram realizados de forma semelhante ao nosso estudo anterior, com cortes de tecido de 6 μm de espessura. Espécimes de bexiga urinária foram imersos e fixados por 1 h em formaldeído 4% gelado em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4) e então enxaguados com solução salina tamponada com fosfato gelada contendo 15% de sacarose por 12 h. Os espécimes de biópsia foram incorporados em meio de temperatura de corte ideal e armazenados a -80 °C. Quatro seções por espécime foram cortadas usando um criostato com uma espessura de 8 μm e coletadas em novas lâminas de vidro revestidas com silano III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tóquio, Japão). Os cortes foram pós-fixados em acetona a -20°C e bloqueados com soro de coelho. As seções foram incubadas durante a noite a 4 °C com anticorpos primários anti-E-caderina humana (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA) ou triptase (Chemicon, Temecula, CA, EUA). Depois de enxaguar as seções com Tween-20 a 0,1% em BPS, aplicaram-se anticorpos secundários isotiocianato de fluoresceína conjugados com anti-rato de coelho (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Dinamarca) e incubou-se nas seções por 1 h. Finalmente, as seções foram contrastadas com 4',6-diamidino-2-fenilindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EUA). Os controles negativos incluíram o isotipo do anticorpo primário. Obtivemos a média, o máximo, o intervalo e o desvio padrão da intensidade da coloração e as medições de porcentagem de área positiva usando três pontos quentes aleatórios dentro de cada amostra.

A quantificação da imunofluorescência foi determinada em quatro campos consecutivos de alta potência (400X) na área de maior densidade. Os ensaios de imunofluorescência (triptase e deoxinucleotidil transferase terminal dUTP nick end-labeling) foram quantificados pela contagem do número de células coradas positivamente por unidade de área (4 μm2) e são apresentados como porcentagens. A intensidade da fluorescência de E-caderina (microscopia de fluorescência) e ZO-1 (microscopia confocal) foi quantificada usando Image J.

Western blotting foi usado para avaliar os níveis de proteínas sensoriais em espécimes da mucosa da bexiga. Os anticorpos primários incluíram P2X3 (1:2000), óxido nítrico sintase endotelial [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) e GAPDH (1:100000; controle interno) da GeneTex ( Irvine, CA, EUA); NOS induzível [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, EUA); e β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Reino Unido). Anticorpos secundários anti-coelho de burro (para β3-AR) ou anti-coelho de cabra (para todas as outras proteínas) IgG-peroxidase de rábano (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, EUA). O filme digitalizado após a eletroforese em gel foi quantificado usando um sistema de documentação de gel (Quantity One Versão 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Reino Unido). Os procedimentos foram semelhantes aos descritos em nosso estudo anterior.

Análise Estatística

As variáveis ​​contínuas foram apresentadas como média ± desvio padrão, e os dados categóricos foram apresentados como números e porcentagens. Os pacientes com LM elegíveis foram agrupados de acordo com o resultado do tratamento e comparados com os controles. As diferenças nos níveis de proteínas funcionais no urotélio na linha de base e 3 e 6 meses após a injeção de onabotulinumtoxinA foram analisadas usando um teste t de Student pareado. Diferenças na imunofluorescência e Western blot de proteínas sensoriais entre os grupos de tratamento com sucesso e falha foram analisadas usando o teste de Kruskal-Wallis. A fim de esclarecer o papel das proteínas sensoriais uroteliais no NDO, também foi realizada análise de correlação usando regressão linear, incluindo VUDS e parâmetros de disfunção urotelial. Todos os cálculos foram feitos usando SPSS para Windows versão 16.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA). As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas se os valores de P fossem menores que 0,05.