Effet de la toxine botulique A sur l'hyperactivité neurogène du détrusor chez les patients atteints de lésions chroniques de la moelle épinière

Au cours des dernières décennies, le traitement de l'hyperactivité neurogène du détrusor (NDO) avec l'onabotulinumtoxinA est apparu comme une méthode alternative pour la prise en charge des complications urologiques dues à une lésion de la moelle épinière (SCI) ou à la sclérose en plaques. L'injection de 200 à 300 U d'onabotulinumtoxinA dans le muscle détrusor peut réduire la contractilité, améliorer la compliance de la vessie et restaurer la continence urinaire chez les patients atteints de NDO. Cependant, une sous-activité détrusorienne se développera après injection de 300 U d'onabotulinumtoxinA et l'amélioration des paramètres urodynamiques et de qualité de vie durera 9 mois. Actuellement, une injection unique de 200 U d'onabotulinumtoxinA dans le détrusor a été recommandée comme traitement standard pour NDO. Cependant, la durée thérapeutique de ce dosage sous NDO était plus courte que celle d'une injection de 300 U.

L'onabotulinumtoxinA améliore efficacement les symptômes des voies urinaires inférieures en inhibant la transmission du signal au niveau des jonctions neuromusculaires et neuroglandulaires. L'onabotulinumtoxinA clive la protéine 25 associée aux synaptosomes et inhibe la transmission du signal en perturbant la fusion des vésicules contenant des neurotransmetteurs avec la paroi neuronale. Dans la vessie, la libération d'acétylcholine par les nerfs parasympathiques pré- et post-ganglionnaires est bloquée après l'administration d'onabotulinumtoxinA. Cette toxine s'est également avérée moduler l'activité afférente de la vessie associée à une réduction des symptômes d'urgence et d'incontinence urinaire d'urgence chez les patients NDO. Bien que l'impact de l'onabotulinumtoxinA sur le système nerveux sympathique dans la vessie ne soit pas clair, il a un effet inhibiteur sur la libération de noradrénaline vers les récepteurs α- et β3-adrénergiques (β3-AR) qui régulent respectivement la contraction du col de la vessie et la relaxation du détrusor.

Une étude précédente a rapporté une diminution de l'expression des protéines d'adhérence et de jonction E-cadhérine et zonula occludens-1 (ZO-1), respectivement, et une augmentation de l'inflammation sous-urothéliale avec apoptose chez les patients atteints de vessie SCI chronique. L'inflammation urothéliale et le dysfonctionnement des vessies SCI pourraient également altérer l'expression des protéines sensorielles, comme dans le récepteur purinergique P2X3, la sous-famille 1 des récepteurs vallinoïdes potentiels des récepteurs transitoires, l'adénosine triphosphate et l'oxyde nitrique. Le dysfonctionnement urothélial pourrait également entraîner une excitabilité accrue des fibres C qui deviennent principalement des nerfs afférents du réflexe de miction après une lésion médullaire. Chez les humains atteints de NDO, les niveaux de la vessie P2X2, P2X3 et des récepteurs muscariniques M2 et M3 ont été réduits après l'injection d'onabotulinumtoxinA dans le détrusor, ce qui suggère que cette toxine inhibe l'OD en inhibant à la fois les bras sensoriel et moteur du réflexe de miction. De plus, les β3-AR sont connus pour favoriser le stockage de l'urine dans la vessie en induisant une relaxation du détrusor dans les vessies animales et humaines. Chez l'homme, le β3-AR est le sous-type de récepteur β prédominant dans la vessie. Il n'y a eu aucun rapport sur les changements de β3-AR dans l'urothélium de la vessie SCI avant ou après le traitement par l'onabotulinumtoxine.

Après l'injection d'onabotulinumtoxinA, les patients peuvent ne présenter aucun symptôme pendant une période de 3 à 6 mois avant que les symptômes ne réapparaissent. La plupart des études sur l'onabotulinumtoxinA sur le NDO proviennent de modèles animaux, et seules quelques études humaines ont été notées. L'étude actuelle a examiné les changements dans le dysfonctionnement urothélial et l'expression des protéines sensorielles dans l'urothélium de la vessie avec le temps après une seule injection d'onabotulinumtoxine chez des patients SCI.

Matériels et méthodes

Un total de 26 patients atteints de SCI chronique provoquant une NDO et une incontinence urinaire ont été traités avec une seule injection de 200 U d'onabotulinumtoxinA dans le muscle du détrusor. Tous les patients présentaient une incontinence urinaire avec ou sans difficulté de vidange vésicale. Chez les patients qui ont reçu des injections dans le détrusor, un cathétérisme intermittent propre a été suggéré comme mode possible de gestion urinaire après le traitement. L'étude actuelle a été approuvée par le comité d'examen institutionnel et le comité d'éthique de l'hôpital général bouddhiste Tzu Chi (IRB:098-53). Chaque patient a été informé de la justification et des procédures de l'étude, et un consentement éclairé écrit pour participer a été obtenu avant toute intervention sur la vessie.

Études urodynamiques vidéo

Tous les patients ont reçu une étude urodynamique vidéo (VUDS) avant leur inscription. Le dysfonctionnement de la vessie et de l'urètre a été classé comme la présence d'OD avec une activité coordonnée ou dyssynergique du sphincter urétral. Les patients atteints d'infection des voies urinaires ont été correctement traités avant qu'ils ne soient programmés pour l'injection d'onabotulinumtoxinA. Les résultats VUDS ont été interprétés selon les recommandations de l'International Continence Society. Les paramètres VUDS comprenaient le débit maximal (Qmax), la pression de miction du détrusor à Qmax (Pdet), la capacité cystométrique de la vessie (CBC), le volume vidé (Vol) et le volume résiduel post-mictionnel (PVR).

Injection d'onabotulinumtoxineA

Tous les patients ont reçu 200 U d'onabotulinumtoxinA dans 20 mL de solution saline normale (BOTOX®, 100 U/flacon, Allergan Inc., Irvine, États-Unis) en salle d'opération par injection cytoscopique rigide (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Allemagne) dans 40 sites de la paroi de la vessie, épargnant le trigoneAprès l'injection, une sonde urétrale de Foley a été systématiquement insérée et retirée le lendemain matin avant que les patients ne sortent. Des antibiotiques à large spectre ont été prescrits pendant 3 jours après le traitement.

Après l'injection d'onabotulinumtoxinA, quatre biopsies vésicales en coupe froide ont été prélevées au hasard sur la paroi postérieure à environ 2 cm au-dessus de la crête inter-urétérale, et seules la muqueuse et la sous-muqueuse vésicales ont été prélevées pour prévenir la perforation vésicale ; toute muqueuse vésicale érythémateuse ou inflammatoire a été évitée. Un spécimen de biopsie de la vessie de chaque patient a été envoyé au service de pathologie pour exclure la possibilité d'un carcinome in situ. Les trois échantillons restants de chaque patient ont été conservés à une température de coupe optimale et dans de l'azote liquide pour d'autres études d'immunohistochimie.

Suivi des patients et évaluation des résultats

Les patients ont été suivis à l'OPD mensuellement, et le VUDS et l'évaluation des conditions de la vessie et de la miction et de la satisfaction à l'égard du traitement ont été effectués 3 et 6 mois après le traitement. Si le CBC augmentait de 50 % par rapport à la valeur initiale, le résultat du traitement était considéré comme un succès ; sinon, le résultat était considéré comme un échec à ce moment-là. Dix patientes souffrant d'incontinence urinaire liée au stress sans urgence fréquente ont servi de témoins. Tous les patients témoins ont été confirmés sans obstruction de la sortie de la vessie ou DO par VUDS. Le tissu vésical témoin a été obtenu pendant la chirurgie anti-incontinence et traité de la même manière que les patients SCI. Les patients de sexe masculin n'ont pas été sélectionnés pour servir de témoins car la prostate pouvait provoquer une obstruction de la sortie de la vessie et affecter la fonction urothéliale.

Immunofluorescence

Des échantillons de tissus vésicaux de patients SCI et de témoins ont été examinés pour les changements dans les niveaux d'E-cadhérine urothéliale (protéine adhésive), de ZO-1 (protéine de jonction) et d'activation des mastocytes (tryptase) par immunofluorescence ; l'apoptose cellulaire a été examinée par un test de marquage terminal de la désoxynucléotidyl transférase dUTP. Ces procédures ont été réalisées de manière similaire à celles de notre étude précédente, avec des coupes de tissu de 6 μm d'épaisseur. Les échantillons de vessie urinaire ont été immergés et fixés pendant 1 h dans du formaldéhyde à 4 % glacé dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4), puis rincés avec une solution saline tamponnée au phosphate glacée contenant 15 % de saccharose pendant 12 h. Les échantillons de biopsie ont été intégrés dans un milieu à température de coupe optimale et stockés à -80 ° C. Quatre sections par échantillon ont été coupées à l'aide d'un cryostat à une épaisseur de 8 μm et collectées sur de nouvelles lames de verre recouvertes de silane III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japon). Les coupes ont été post-fixées dans de l'acétone à -20 °C et bloquées avec du sérum de lapin. Les coupes ont été incubées pendant une nuit à 4 ° C avec des anticorps primaires anti-E-cadhérine humaine (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) ou tryptase (Chemicon, Temecula, CA, USA). Après rinçage des sections avec 0, 1% de Tween-20 dans du BPS, des anticorps secondaires isothiocyanate de fluorescéine conjugués à l'antisouris de lapin (DakoCytomation Danemark A / S, Glostrup, Danemark) ont été appliqués et incubés sur les sections pendant 1 h. Enfin, les coupes ont été contre-colorées avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Les témoins négatifs comprenaient l'isotype de l'anticorps primaire. Nous avons obtenu la moyenne, le maximum, la plage et l'écart type des mesures d'intensité de coloration et de pourcentage de surface positive en utilisant trois points chauds aléatoires dans chaque échantillon.

La quantification de l'immunofluorescence a été déterminée dans quatre champs consécutifs à haute puissance (400X) dans la zone avec la plus grande densité. Les tests d'immunofluorescence (tryptase et désoxynucléotidyl transférase terminale dUTP nick end-labeling) ont été quantifiés en comptant le nombre de cellules colorées positivement par unité de surface (4 μm2) et sont indiqués en pourcentages. L'intensité de la fluorescence de la E-cadhérine (microscopie à fluorescence) et de la ZO-1 (microscopie confocale) a été quantifiée à l'aide de l'image J.

Western blot a été utilisé pour évaluer les niveaux de protéines sensorielles dans des échantillons de muqueuse vésicale. Les anticorps primaires comprenaient P2X3 (1:2000), l'oxyde nitrique endothélial synthase [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) et GAPDH (1:100000; contrôle interne) de GeneTex ( Irvine, Californie, États-Unis); NOS inductible [iNOS] (1:1500 ; ThermoFisher, Rockford, IL, États-Unis ); et β3-AR (1:1000 ; Abcam, Cambridge, Royaume-Uni). Des anticorps secondaires IgG-peroxydase de raifort (1: 3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, États-Unis) ont été utilisés. Le film scanné après électrophorèse sur gel a été quantifié à l'aide d'un système de documentation sur gel (Quantity One Version 4.6.2, Laboratoires Bio-Rad, Hemel Hempstead, Herts, Royaume-Uni). Les procédures étaient similaires à celles décrites dans notre étude précédente.

Analyses statistiques

Les variables continues ont été présentées sous forme de moyennes ± écarts-types, et les données catégorielles ont été présentées sous forme de nombres et de pourcentages. Les patients atteints de lésions médullaires éligibles ont été regroupés en fonction des résultats du traitement et comparés aux témoins. Les différences dans les niveaux de protéines fonctionnelles dans l'urothélium au départ et 3 et 6 mois après l'injection d'onabotulinumtoxinA ont été analysées à l'aide d'un test t de Student apparié. Les différences d'immunofluorescence et de Western blot des protéines sensorielles entre les groupes de traitement réussis et échoués ont été analysées à l'aide du test de Kruskal-Wallis. Afin de clarifier les rôles des protéines sensorielles urothéliales dans le NDO, une analyse de corrélation utilisant la régression linéaire a également été réalisée, y compris les paramètres VUDS et de dysfonctionnement urothélial. Tous les calculs ont été effectués à l'aide de SPSS pour Windows version 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Les différences étaient considérées comme statistiquement significatives si les valeurs P étaient inférieures à 0,05.