Effect van botulinumtoxine A op neurogene detrusoroveractiviteit bij patiënten met chronische ruggenmergletsel

In de afgelopen decennia is de behandeling van neurogene detrusoroveractiviteit (NDO) met onabotulinumtoxinA naar voren gekomen als een alternatieve methode voor de behandeling van urologische complicaties als gevolg van dwarslaesie (SCI) of multiple sclerose. Injectie van 200-300 E onabotulinumtoxinA in de detrusorspier kan de contractiliteit verminderen, de blaascompliantie verbeteren en urine-continentie herstellen bij patiënten met NDO. Detrusor-onderactiviteit zal zich echter ontwikkelen na injectie van 300 E onabotulinumtoxinA en verbetering van urodynamische parameters en kwaliteit van leven duurde 9 maanden. Momenteel wordt een eenmalige injectie van 200 E met onabotulinumtoxinA in de detrusor aanbevolen als standaardbehandeling voor NDO. De therapeutische duur van deze dosering op NDO was echter korter dan die van een injectie van 300 E.

OnabotulinumtoxinA verbetert effectief de symptomen van de lagere urinewegen door de signaaloverdracht op de neuromusculaire en neuroglandulaire verbindingen te remmen. OnabotulinumtoxinA splitst synaptosoom-geassocieerd eiwit 25 en remt de signaaloverdracht door de fusie van neurotransmitterbevattende blaasjes met de neuronale wand te verstoren. In de urineblaas wordt de afgifte van acetylcholine uit zowel pre- als postganglionische parasympathische zenuwen geblokkeerd na toediening van onabotulinumtoxine A. Dit toxine bleek ook de afferente activiteit van de blaas te moduleren, geassocieerd met verminderde urgentie en urgentie-urine-incontinentiesymptomen bij NDO-patiënten. Hoewel de impact van onabotulinumtoxine A op het sympathische zenuwstelsel in de urineblaas onduidelijk is, heeft het een remmend effect op de afgifte van norepinefrine aan α- en β3-adrenoreceptoren (β3-AR's) die respectievelijk de blaashalscontractie en detrusorrelaxatie reguleren.

Een eerdere studie rapporteerde verminderde expressie van adhesie- en junctie-eiwitten E-cadherine en zonula occludens-1 (ZO-1), respectievelijk, en verhoogde suburotheelontsteking met apoptose bij patiënten met chronische dwarslaesie-blazen. De urotheliale ontsteking en disfunctie in dwarslaesie-blazen kan ook sensorische eiwitexpressie veranderen, zoals in purinerge receptor P2X3, tijdelijke receptorpotentiaal vallinoïde receptor subfamilie 1, adenosinetrifosfaat en stikstofmonoxide. Urotheliale disfunctie kan ook resulteren in een verhoogde prikkelbaarheid van de C-vezels, die na SCI overwegend afferente zenuwen van de mictiereflex worden. Bij mensen met NDO waren de niveaus van blaas P2X2, P2X3 en muscarinereceptoren M2 en M3 verlaagd na detrusor-onabotulinumtoxinA-injectie, wat suggereert dat dit toxine DO remt door zowel de sensorische als de motorische armen van de mictiereflex te remmen. Bovendien is bekend dat β3-AR's de opslag van urine in de blaas bevorderen door detrusorrelaxatie in de blazen van dieren en mensen te induceren. Bij mensen is β3-AR het overheersende β-receptorsubtype in de urineblaas. Er is geen melding gemaakt van β3-AR-veranderingen in SCI-blaasurotheel voor of na behandeling met onabotulinumtoxine.

Na een injectie met onabotulinumtoxine A kunnen patiënten gedurende een periode van 3-6 maanden symptoomvrij zijn voordat de symptomen terugkeren. De meeste onderzoeken naar onabotulinumtoxinA op NDO zijn afkomstig van diermodellen en er zijn slechts enkele studies bij mensen genoteerd. De huidige studie onderzocht veranderingen in urotheliale disfunctie en sensorische eiwitexpressie in het blaasurotheel met de tijd na een enkele onabotulinumtoxine-injectie bij dwarslaesiepatiënten.

Materialen en methodes

In totaal werden 26 patiënten met chronische dwarslaesie die NDO en urine-incontinentie veroorzaakte, behandeld met een enkele injectie van 200 E onabotulinumtoxinA in de detrusorspier. Alle patiënten presenteerden zich met urine-incontinentie met of zonder moeilijkheden bij het ledigen van de blaas. Bij patiënten die detrusorinjecties kregen, werd schone intermitterende katheterisatie voorgesteld als een mogelijke manier van urinebeheer na behandeling. De huidige studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board and Ethics Committee van het boeddhistische Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Elke patiënt werd geïnformeerd over de grondgedachte en procedures van het onderzoek, en schriftelijke geïnformeerde toestemming voor deelname werd verkregen vóór elke blaasprocedure.

Video urodynamische studies

Alle patiënten kregen vóór hun inschrijving een video-urodynamisch onderzoek (VUDS). Blaas- en urethrale disfunctie werden geclassificeerd als de aanwezigheid van DO met gecoördineerde of dyssynergische urethrale sluitspieractiviteit. Patiënten met een urineweginfectie werden correct behandeld voordat ze een injectie met onabotulinumtoxine A kregen. VUDS-resultaten werden geïnterpreteerd volgens de aanbevelingen van de International Continence Society. VUDS-parameters waren onder meer maximale stroomsnelheid (Qmax), detrusorledigingsdruk bij Qmax (Pdet), cystometrische blaascapaciteit (CBC), geledigd volume (Vol) en restvolume na leegte (PVR).

Onabotulinumtoxine Een injectie

Alle patiënten kregen 200 E onabotulinumtoxinA in 20 ml normale zoutoplossing (BOTOX®, 100 E/flacon, Allergan Inc., Irvine, VS) in de operatiekamer door middel van rigide cytoscopische injectie (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Duitsland) in 40 eenheden. plaatsen van de blaaswand, waarbij de trigone wordt gespaard. Na injectie werd routinematig een urethrale Foley-katheter ingebracht en de volgende ochtend verwijderd voordat de patiënten werden ontslagen. Breedspectrumantibiotica werden gedurende 3 dagen na de behandeling voorgeschreven.

Na injectie met onabotulinumtoxine A werden willekeurig vier blaasbiopten genomen van de achterwand, ongeveer 2 cm boven de interureterische rand, en alleen het blaasslijmvlies en de submucosa werden genomen om blaasperforatie te voorkomen; elke erythemateuze of inflammatoire blaasmucosa werd vermeden. Van elke patiënt werd één blaasbiopsie naar de afdeling pathologie gestuurd om de mogelijkheid van carcinoom in situ uit te sluiten. De resterende drie monsters van elke patiënt werden bewaard bij optimale snijtemperatuur en in vloeibare stikstof voor verder immunohistochemisch onderzoek.

Follow-up van de patiënt en beoordeling van het resultaat

Patiënten werden maandelijks opgevolgd bij OPD, en VUDS en beoordeling van blaas- en mictiecondities en tevredenheid met de behandeling werden 3 en 6 maanden na de behandeling uitgevoerd. Als de CBC met 50% toenam ten opzichte van de uitgangswaarde, werd het resultaat van de behandeling als succesvol beschouwd; anders werd het resultaat op dat tijdstip als een mislukking beschouwd. Tien vrouwelijke patiënten met stressgerelateerde urine-incontinentie zonder frequente aandrang dienden als controlegroep. Van alle controlepatiënten werd bevestigd dat ze vrij waren van obstructie van de blaasuitgang of DO door middel van VUDS. Controleblaasweefsel werd verkregen tijdens anti-incontinentiechirurgie en op dezelfde manier verwerkt als SCI-patiënten. Mannelijke patiënten werden niet geselecteerd om als controlegroep te dienen omdat de prostaat obstructie van de blaasuitgang zou kunnen veroorzaken en de urotheliale functie zou kunnen aantasten.

Immunofluorescentie

Blaasweefselmonsters van SCI-patiënten en controles werden onderzocht op veranderingen in urotheliale E-cadherine (adhesief eiwit), ZO-1 (junctie-eiwit) en mestcelactivatie (tryptase) niveaus door immunofluorescentie; cellulaire apoptose werd onderzocht door terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end-labeling assay. Deze procedures werden op dezelfde manier uitgevoerd als in onze vorige studie, met weefselsecties met een dikte van 6 μm. Urineblaasmonsters werden ondergedompeld en gedurende 1 uur gefixeerd in ijskoude 4% formaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) en vervolgens gedurende 12 uur gespoeld met ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing die 15% sucrose bevat. Biopsiespecimens werden ingebed in medium met optimale snijtemperatuur en bewaard bij -80 °C. Vier secties per monster werden gesneden met behulp van een cryostaat met een dikte van 8 μm en verzameld op nieuwe met silaan III gecoate glasplaatjes (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan). Secties werden achteraf gefixeerd in aceton bij -20°C en geblokkeerd met konijnenserum. De secties werden overnacht bij 4 ° C geïncubeerd met antihumane E-cadherine (BD Biosciences, San Jose, CA, VS) of tryptase (Chemicon, Temecula, CA, VS) primaire antilichamen. Na het spoelen van de coupes met 0,1% Tween-20 in BPS, werden konijnen-antimuis-geconjugeerde fluoresceïne-isothiocyanaat-secundaire antilichamen (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Denemarken) aangebracht en gedurende 1 uur op coupes geïncubeerd. Ten slotte werden secties tegengekleurd met 4',6-diamidino-2-fenylindool (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, VS). Negatieve controles omvatten het isotype van het primaire antilichaam. We verkregen het gemiddelde, maximum, bereik en standaarddeviatie van de kleuringsintensiteit en procentuele positieve gebiedsmetingen met behulp van drie willekeurige hotspots binnen elk monster.

Immunofluorescentiekwantificering werd bepaald in vier opeenvolgende velden met hoog vermogen (400X) in het gebied met de grootste dichtheid. Immunofluorescentietesten (tryptase en terminale deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end-labeling) werden gekwantificeerd door het aantal positief gekleurde cellen per oppervlakte-eenheid (4 μm2) te tellen en worden weergegeven als percentages. De intensiteit van E-cadherine (fluorescentiemicroscopie) en ZO-1 (confocale microscopie) fluorescentie werd gekwantificeerd met afbeelding J.

Western-blotting werd gebruikt om de niveaus van sensorische eiwitten in monsters van het blaasslijmvlies te beoordelen. Primaire antilichamen omvatten P2X3 (1:2000), endotheliaal stikstofoxidesynthase [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) en GAPDH (1:100000; interne controle) van GeneTex ( Irvine, CA, VS); induceerbare NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, VS); en β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, VK). Ezel-antigeit (voor β3-AR) of geit-antikonijn (voor alle andere eiwitten) IgG-mierikswortelperoxidase (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, VS) secundaire antilichamen werden gebruikt. De gescande film na gelelektroforese werd gekwantificeerd met behulp van een geldocumentatiesysteem (Quantity One versie 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, VK). Procedures waren vergelijkbaar met die beschreven in onze vorige studie.

Statistische analyse

Continue variabelen werden gepresenteerd als gemiddelden ± standaarddeviaties, en categorische gegevens werden gepresenteerd als getallen en percentages. In aanmerking komende SCI-patiënten werden gegroepeerd op basis van het behandelresultaat en vergeleken met controles. Verschillen in de niveaus van functionele eiwitten in het urotheel bij aanvang en 3 en 6 maanden na injectie met onabotulinumtoxine A werden geanalyseerd met behulp van een gepaarde Student's t-test. Verschillen in immunofluorescentie en Western-blot van sensorische eiwitten tussen succesvolle en mislukte behandelingsgroepen werden geanalyseerd met behulp van de Kruskal-Wallis-test. Om de rol van urotheliale sensorische eiwitten in NDO te verduidelijken, werd ook een correlatieanalyse uitgevoerd met behulp van lineaire regressie, inclusief VUDS en parameters voor urotheliale disfunctie. Alle berekeningen zijn gedaan met behulp van SPSS voor Windows versie 16.0 (SPSS, Chicago, IL, VS). Verschillen werden als statistisch significant beschouwd als P-waarden kleiner waren dan 0,05.