Effekt av botulinumtoksin A på nevrogen detrusor-overaktivitet hos kroniske ryggmargsskadde pasienter

I de siste tiårene har behandling av nevrogen detrusoroveraktivitet (NDO) med onabotulinumtoxinA dukket opp som en alternativ metode for behandling av urologiske komplikasjoner på grunn av ryggmargsskade (SCI) eller multippel sklerose. Injeksjon av 200-300 E av onabotulinumtoxinA i detrusormuskelen kan redusere kontraktilitet, forbedre blærekompatibilitet og gjenopprette urinkontinens hos pasienter med NDO. Imidlertid vil detrusorunderaktivitet utvikles etter injeksjon av 300 U onabotulinumtoxinA og forbedring av urodynamiske og livskvalitetsparametre varte i 9 måneder. For øyeblikket er en 200 E enkeltinjeksjon av onabotulinumtoxinA i detrusoren anbefalt som standardbehandling for NDO. Imidlertid var den terapeutiske varigheten av denne dosen på NDO kortere enn for en 300 U-injeksjon.

OnabotulinumtoxinA forbedrer effektivt symptomer på nedre urinveier ved å hemme signaloverføring ved de nevromuskulære og neuroglandulære kryssene. OnabotulinumtoxinA spalter synaptosomassosiert protein 25 og hemmer signaloverføring ved å forstyrre fusjon av nevrotransmitterholdige vesikler med nevronveggen. I urinblæren blokkeres frigjøring av acetylkolin fra både pre- og postganglioniske parasympatiske nerver etter administrering av onabotulinumtoxinA. Dette toksinet ble også funnet å modulere afferent aktivitet av blæren assosiert med reduserte haster og haster urininkontinenssymptomer hos NDO-pasienter. Selv om virkningen av onabotulinumtoxinA på det sympatiske nervesystemet i urinblæren er uklar, har det en hemmende effekt på frigjøring av noradrenalin til α- og β3-adrenoreseptorer (β3-ARs) som regulerer henholdsvis blærehalssammentrekning og detrusoravslapping.

En tidligere studie rapporterte redusert ekspresjon av henholdsvis adhesjons- og koblingsproteinene E-cadherin og zonula occludens-1 (ZO-1), og økt suburotelial betennelse med apoptose hos pasienter med kroniske SCI-blærer. Urothelial betennelse og dysfunksjon i SCI-blærer kan også endre sensorisk proteinekspresjon, slik som i purinerg reseptor P2X3, transient reseptor potensiell vallinoid reseptor underfamilie 1, adenosintrifosfat og nitrogenoksid. Urothelial dysfunksjon kan også resultere i økt eksitabilitet av C-fibrene, som hovedsakelig blir afferente nerver til miksjonsrefleksen etter SCI. Hos mennesker med NDO ble nivåene av blære P2X2, P2X3 og muskarine reseptorer M2 og M3 redusert etter injeksjon av detrusor onabotulinumtoxinA, noe som tyder på at dette toksinet hemmer DO ved å hemme både de sensoriske og motoriske armene til miksjonsrefleksen. I tillegg er β3-AR kjent for å fremme urinlagring i blæren ved å indusere detrusoravslapning i dyre- og menneskeblærer. Hos mennesker er β3-AR den dominerende β-reseptorsubtypen i urinblæren. Det har ikke vært rapportert om β3-AR endringer i SCI blære urotel før eller etter behandling med onabotulinumtoksin.

Etter onabotulinumtoxinA-injeksjon kan pasienter være symptomfrie i en periode på 3-6 måneder før symptomene får tilbakefall. De fleste studier av onabotulinumtoxinA på NDO kommer fra dyremodeller, og bare noen få menneskelige studier er notert. Den nåværende studien undersøkte endringer i urotelial dysfunksjon og sensorisk proteinekspresjon i blærens urotel med tid etter en enkelt onabotulinumtoksininjeksjon hos SCI-pasienter.

Materialer og metoder

Totalt 26 pasienter med kronisk SCI som forårsaker NDO og urininkontinens ble behandlet med en enkelt injeksjon av 200 U onabotulinumtoxinA til detrusormuskelen. Alle pasienter presenterte urininkontinens med eller uten vanskelig blæretømming. Hos pasienter som fikk detrusorinjeksjoner, ble ren intermitterende kateterisering foreslått som en mulig måte for urinveisbehandling etter behandling. Den nåværende studien ble godkjent av Institutional Review Board and Ethics Committee of Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Hver pasient ble informert om studiens begrunnelse og prosedyrer, og skriftlig informert samtykke til å delta ble innhentet før enhver blæreprosedyre.

Video urodynamiske studier

Alle pasientene mottok en videourodynamisk studie (VUDS) før de ble registrert. Blære- og urinrørsdysfunksjon ble klassifisert som tilstedeværelse av DO med koordinert eller dyssynergisk urethral sphincter-aktivitet. Pasienter med urinveisinfeksjon ble riktig behandlet før de ble planlagt for onabotulinumtoxinA-injeksjon. VUDS-resultater ble tolket i henhold til anbefalingene fra International Continence Society. VUDS-parametere inkluderte maksimal strømningshastighet (Qmax), detrusor-tømmetrykk ved Qmax (Pdet), cystometrisk blærekapasitet (CBC), void-volum (Vol) og post-void-restvolum (PVR).

OnabotulinumtoxinA-injeksjon

Alle pasienter mottok 200 E onabotulinumtoxinA i 20 mL normal saltvann (BOTOX®, 100 E/hetteglass, Allergan Inc., Irvine, USA) på operasjonsrommet ved stiv cytoskopisk injeksjon (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Tyskland) i 40 steder av blæreveggen, sparer trigonen Etter injeksjon ble et urethral Foley-kateter rutinemessig satt inn og fjernet neste morgen før pasientene ble skrevet ut. Bredspektret antibiotika ble foreskrevet i 3 dager etter behandling.

Etter onabotulinumtoxinA-injeksjon ble fire kaldkopp-biopsier tatt tilfeldig ved bakveggen ca. 2 cm over den interureteriske ryggen, og bare blæreslimhinnen og submucosa ble tatt for å forhindre blæreperforering; enhver erytematøs eller inflammatorisk blæreslimhinne ble unngått. Én blærebiopsiprøve fra hver pasient ble sendt til patologiavdelingen for å utelukke muligheten for karsinom in situ. De resterende tre prøvene fra hver pasient ble lagret ved optimal kuttetemperatur og i flytende nitrogen for videre immunhistokjemistudier.

Pasientoppfølging og resultatvurdering

Pasientene ble fulgt opp ved OPD månedlig, og VUDS og vurdering av blære- og tømmetilstander og tilfredshet med behandlingen ble utført 3 og 6 måneder etter behandling. Hvis CBC økte med 50 % fra baseline-verdien, ble behandlingsresultatet ansett som vellykket; ellers ble resultatet ansett som en fiasko på det tidspunktet. Ti kvinnelige pasienter med stressrelatert urininkontinens uten hyppig hasting fungerte som kontroller. Alle kontrollpasienter ble bekreftet fri for blæreutløpsobstruksjon eller DO av VUDS. Kontrollblærevev ble oppnådd under antiinkontinenskirurgi og behandlet på samme måte som SCI-pasienter. Mannlige pasienter ble ikke valgt til å tjene som kontroller fordi prostata kunne forårsake obstruksjon av blæreutløp og påvirke urotelfunksjonen.

Immunfluorescens

Blærevevsprøver fra SCI-pasienter og kontroller ble undersøkt for endringer i urotelial E-cadherin (klebende protein), ZO-1 (junction protein) og mastcelleaktivering (tryptase) nivåer ved immunfluorescens; cellulær apoptose ble undersøkt ved terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick-endemerkingsanalyse. Disse prosedyrene ble utført på samme måte som i vår forrige studie, med 6-μm tykkelse vevssnitt. Urinblæreprøver ble nedsenket og fiksert i 1 time i iskaldt 4 % formaldehyd i fosfatbufret saltvann (pH 7,4) og deretter skylt med iskaldt fosfatbufret saltvann inneholdende 15 % sukrose i 12 timer. Biopsiprøver ble lagt inn i medium med optimal kuttetemperatur og lagret ved -80 °C. Fire seksjoner per prøve ble kuttet ved hjelp av en kryostat i en tykkelse på 8 μm og samlet på nye silan III-belagte glassglass (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan). Seksjoner ble etterfiksert i aceton ved -20 °C og blokkert med kaninserum. Seksjonene ble inkubert over natten ved 4 ° C med antihumant E-cadherin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) eller tryptase (Chemicon, Temecula, CA, USA) primære antistoffer. Etter skylling av seksjonene med 0,1 % Tween-20 i BPS, ble kanin-antimus-konjugerte fluorescein-isotiocyanat-sekundære antistoffer (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Danmark) påført og inkubert på seksjoner i 1 time. Til slutt ble seksjoner motfarget med 4',6-diamidino-2-fenylindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Negative kontroller inkluderte isotypen til det primære antistoffet. Vi oppnådde gjennomsnitt, maksimum, rekkevidde og standardavvik for fargeintensiteten og prosentvis positive arealmålinger ved å bruke tre tilfeldige hot spots i hver prøve.

Immunfluorescenskvantifisering ble bestemt i fire påfølgende høyeffektfelt (400X) i området med størst tetthet. Immunfluorescens (tryptase og terminal deoksynukleotidyltransferase dUTP nick-endemerking) analyser ble kvantifisert ved å telle antall positivt fargede celler per enhetsareal (4 μm2) og vises som prosenter. Intensiteten til E-cadherin (fluorescensmikroskopi) og ZO-1 (konfokal mikroskopi) fluorescens ble kvantifisert ved å bruke Image J.

Western blotting ble brukt for å vurdere nivåene av sensoriske proteiner i blæreslimhinneprøver. Primære antistoffer inkluderte P2X3 (1:2000), endotel nitrogenoksidsyntase [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) og GAPDH (1:100000; internkontroll) fra GeneTex ( Irvine, CA, USA); induserbar NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); og β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Storbritannia). Esel-antigeit (for β3-AR) eller geit-antikanin (for alle andre proteiner) IgG-pepperrotperoksidase (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ble brukt. Den skannede filmen etter gelelektroforese ble kvantifisert ved hjelp av et geldokumentasjonssystem (Quantity One versjon 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Storbritannia). Prosedyrene var lik de som ble beskrevet i vår forrige studie.

Statistisk analyse

Kontinuerlige variabler ble presentert som gjennomsnitt ± standardavvik, og kategoriske data ble presentert som tall og prosenter. Kvalifiserte SCI-pasienter ble gruppert etter behandlingsresultat og sammenlignet med kontroller. Forskjeller i nivåene av funksjonelle proteiner i urothelium ved baseline og 3 og 6 måneder etter onabotulinumtoxinA-injeksjon ble analysert ved å bruke en sammenkoblet Students t-test. Forskjeller i immunfluorescens og Western blot av sensoriske proteiner mellom vellykkede og mislykkede behandlingsgrupper ble analysert ved bruk av Kruskal-Wallis-testen. For å klargjøre rollene til uroteliale sensoriske proteiner i NDO, ble det også utført korrelasjonsanalyse ved bruk av lineær regresjon, inkludert VUDS og uroteliale dysfunksjonsparametere. Alle beregninger ble gjort med SPSS for Windows versjon 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Forskjeller ble ansett som statistisk signifikante hvis P-verdier var mindre enn 0,05.