Effetto della tossina botulinica A sull'iperattività neurogena del detrusore nei pazienti con lesioni croniche del midollo spinale

Negli ultimi decenni, il trattamento dell'iperattività detrusoriale neurogena (NDO) con onabotulinumtoxinA è emerso come metodo alternativo per la gestione delle complicanze urologiche dovute a lesioni del midollo spinale (SCI) o sclerosi multipla. L'iniezione di 200-300 U di onabotulinumtoxinA nel muscolo detrusore può ridurre la contrattilità, migliorare la compliance della vescica e ripristinare la continenza urinaria nei pazienti con NDO. Tuttavia, l'ipoattività del detrusore si svilupperà dopo l'iniezione di 300 U di onabotulinumtoxinA e il miglioramento dei parametri urodinamici e della qualità della vita è durato 9 mesi. Attualmente, una singola iniezione di 200 U di onabotulinumtoxinA nel detrusore è stata raccomandata come trattamento standard per NDO. Tuttavia, la durata terapeutica di questo dosaggio su NDO è stata inferiore a quella di un'iniezione di 300 U.

OnabotulinumtoxinA migliora efficacemente i sintomi del tratto urinario inferiore inibendo la trasmissione del segnale alle giunzioni neuromuscolari e neuroghiandolari. OnabotulinumtoxinA scinde la proteina 25 associata al sinaptosoma e inibisce la trasmissione del segnale interrompendo la fusione delle vescicole contenenti neurotrasmettitore con la parete neuronale. Nella vescica urinaria, il rilascio di acetilcolina dai nervi parasimpatici pre e postgangliari viene bloccato dopo la somministrazione di onabotulinumtoxinA. È stato anche scoperto che questa tossina modula l'attività afferente della vescica associata a ridotta urgenza e sintomi di incontinenza urinaria da urgenza nei pazienti NDO. Sebbene l'impatto di onabotulinumtoxinA sul sistema nervoso simpatico all'interno della vescica urinaria non sia chiaro, ha un effetto inibitorio sul rilascio di noradrenalina agli α- e β3-adrenergici (β3-AR) che regolano rispettivamente la contrazione del collo vescicale e il rilassamento del detrusore.

Uno studio precedente ha riportato una diminuzione dell'espressione delle proteine ​​​​di adesione e giunzione E-caderina e zonula occludens-1 (ZO-1), rispettivamente, e un aumento dell'infiammazione suburoteliale con apoptosi in pazienti con vesciche SCI croniche. L'infiammazione e la disfunzione uroteliale nelle vesciche SCI potrebbero anche alterare l'espressione della proteina sensoriale, come nel recettore purinergico P2X3, sottofamiglia 1 del recettore vallinoide del potenziale transitorio del recettore, adenosina trifosfato e ossido nitrico. La disfunzione uroteliale potrebbe anche provocare un aumento dell'eccitabilità delle fibre C che diventano prevalentemente nervi afferenti del riflesso della minzione dopo la SCI. Negli esseri umani con NDO, i livelli della vescica P2X2, P2X3 e dei recettori muscarinici M2 e M3 sono stati ridotti dopo l'iniezione del detrusore onabotulinumtoxinA, suggerendo che questa tossina inibisce il DO inibendo sia il braccio sensoriale che quello motorio del riflesso della minzione. Inoltre, è noto che i β3-AR promuovono l'immagazzinamento dell'urina nella vescica inducendo il rilassamento del detrusore nelle vesciche animali e umane. Negli esseri umani, β3-AR è il sottotipo di β-recettore predominante nella vescica urinaria. Non sono stati segnalati cambiamenti di β3-AR nell'urotelio della vescica SCI prima o dopo il trattamento con onabotulinumtoxin.

Dopo l'iniezione di onabotulinumtoxinA, i pazienti possono essere asintomatici per un periodo di 3-6 mesi prima della ricaduta dei sintomi. La maggior parte degli studi di onabotulinumtoxinA su NDO provengono da modelli animali e sono stati notati solo pochi studi sull'uomo. L'attuale studio ha studiato i cambiamenti nella disfunzione uroteliale e nell'espressione proteica sensoriale nell'urotelio della vescica con il tempo dopo una singola iniezione di onabotulinumtoxin nei pazienti con LM.

Materiali e metodi

Un totale di 26 pazienti con LM cronica che causa NDO e incontinenza urinaria sono stati trattati con una singola iniezione di 200 U di onabotulinumtoxinA nel muscolo detrusore. Tutti i pazienti presentavano incontinenza urinaria con o senza difficoltà di svuotamento vescicale. Nei pazienti che hanno ricevuto iniezioni del detrusore, è stato suggerito il cateterismo intermittente pulito come possibile modalità di gestione urinaria dopo il trattamento. L'attuale studio è stato approvato dall'Institutional Review Board e dal Comitato etico del Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53). Ogni paziente è stato informato del razionale e delle procedure dello studio ed è stato ottenuto il consenso informato scritto alla partecipazione prima di qualsiasi procedura vescicale.

Video studi urodinamici

Tutti i pazienti hanno ricevuto uno studio video urodinamico (VUDS) prima della loro iscrizione. La disfunzione vescicale e uretrale è stata classificata come presenza di DO con attività coordinata o dissinergica dello sfintere uretrale. I pazienti con infezione del tratto urinario sono stati adeguatamente trattati prima di essere programmati per l'iniezione di onabotulinumtoxinA. I risultati VUDS sono stati interpretati secondo le raccomandazioni dell'International Continence Society. I parametri VUDS includevano la portata massima (Qmax), la pressione di svuotamento detrusoriale a Qmax (Pdet), la capacità cistometrica della vescica (CBC), il volume svuotato (Vol) e il volume residuo post-minzionale (PVR).

Iniezione di OnabotulinumtoxinA

Tutti i pazienti hanno ricevuto 200 U di onabotulinumtoxinA in 20 mL di soluzione salina normale (BOTOX®, 100 U/fiala, Allergan Inc., Irvine, USA) in sala operatoria mediante iniezione citoscopica rigida (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Germania) in 40 siti della parete della vescica, risparmiando il trigoneDopo l'iniezione, un catetere di Foley uretrale è stato sistematicamente inserito e rimosso la mattina successiva prima che i pazienti fossero dimessi. Gli antibiotici ad ampio spettro sono stati prescritti per 3 giorni dopo il trattamento.

Dopo l'iniezione di onabotulinumtoxinA, sono state prelevate casualmente quattro biopsie della vescica fredda sulla parete posteriore a circa 2 cm sopra la cresta interureterica e sono state prelevate solo la mucosa e la sottomucosa della vescica per prevenire la perforazione della vescica; qualsiasi mucosa vescicale eritematosa o infiammatoria è stata evitata. Un campione di biopsia vescicale di ciascun paziente è stato inviato al reparto di patologia per escludere la possibilità di carcinoma in situ. I restanti tre campioni di ciascun paziente sono stati conservati a una temperatura di taglio ottimale e in azoto liquido per ulteriori studi di immunoistochimica.

Follow-up del paziente e valutazione dei risultati

I pazienti sono stati seguiti all'OPD mensilmente e la VUDS e la valutazione delle condizioni della vescica e dello svuotamento e la soddisfazione per il trattamento sono state eseguite 3 e 6 mesi dopo il trattamento. Se l'emocromo è aumentato del 50% rispetto al valore basale, l'esito del trattamento è stato considerato positivo; in caso contrario, il risultato è stato considerato un fallimento in quel momento. Dieci pazienti di sesso femminile con incontinenza urinaria correlata allo stress senza urgenza frequente servivano come controlli. Tutti i pazienti di controllo sono stati confermati liberi da ostruzione dello sbocco vescicale o DO da VUDS. Il tessuto della vescica di controllo è stato ottenuto durante l'intervento chirurgico anti-incontinenza ed elaborato allo stesso modo dei pazienti con SCI. I pazienti di sesso maschile non sono stati selezionati come controlli perché la prostata potrebbe causare l'ostruzione dell'uscita della vescica e influenzare la funzione uroteliale.

Immunofluorescenza

I campioni di tessuto vescicale di pazienti con SCI e controlli sono stati esaminati per i cambiamenti nei livelli di caderina E uroteliale (proteina adesiva), ZO-1 (proteina di giunzione) e attivazione dei mastociti (triptasi) mediante immunofluorescenza; l'apoptosi cellulare è stata esaminata mediante il test di etichettatura terminale della deossinucleotidil transferasi dUTP nick. Queste procedure sono state eseguite in modo simile a quelle del nostro studio precedente, con sezioni di tessuto di 6 μm di spessore. I campioni di vescica urinaria sono stati immersi e fissati per 1 ora in formaldeide ghiacciata al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato (pH 7,4), quindi risciacquati con soluzione salina tamponata con fosfato ghiacciata contenente il 15% di saccarosio per 12 ore. I campioni bioptici sono stati incorporati in un mezzo a temperatura di taglio ottimale e conservati a -80 °C. Quattro sezioni per campione sono state tagliate utilizzando un criostato con uno spessore di 8 μm e raccolte su nuovi vetrini rivestiti con silano III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Giappone). Le sezioni sono state postfissate in acetone a -20°C e bloccate con siero di coniglio. Le sezioni sono state incubate durante la notte a 4 ° C con anticorpi primari antiumani E-caderina (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) o triptasi (Chemicon, Temecula, CA, USA). Dopo aver risciacquato le sezioni con Tween-20 allo 0, 1% in BPS, gli anticorpi secondari di isotiocianato di fluoresceina coniugati con coniglio anti-topo (DakoCytomation Denmark A / S, Glostrup, Danimarca) sono stati applicati e incubati su sezioni per 1 ora. Infine, le sezioni sono state controcolorate con 4',6-diamidino-2-fenilindolo (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). I controlli negativi includevano l'isotipo dell'anticorpo primario. Abbiamo ottenuto la media, il massimo, l'intervallo e la deviazione standard dell'intensità della colorazione e delle misurazioni dell'area positiva percentuale utilizzando tre punti caldi casuali all'interno di ciascun campione.

La quantificazione dell'immunofluorescenza è stata determinata in quattro campi consecutivi ad alta potenza (400X) nell'area con la maggiore densità. I test di immunofluorescenza (triptasi e deossinucleotidil transferasi terminale dUTP nick end-labeling) sono stati quantificati contando il numero di cellule colorate positivamente per unità di area (4 μm2) e sono mostrati come percentuali. L'intensità della fluorescenza E-caderina (microscopia a fluorescenza) e ZO-1 (microscopia confocale) è stata quantificata utilizzando l'immagine J.

Il western blotting è stato utilizzato per valutare i livelli di proteine ​​sensoriali nei campioni di mucosa della vescica. Gli anticorpi primari includevano P2X3 (1:2000), ossido nitrico sintasi endoteliale [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) e GAPDH (1:100000; controllo interno) da GeneTex ( Irvine, California, Stati Uniti); NOS inducibile [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); e β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, Regno Unito). Sono stati utilizzati anticorpi secondari IgG-perossidasi di rafano (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Il film scansionato dopo l'elettroforesi su gel è stato quantificato utilizzando un sistema di documentazione su gel (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, Regno Unito). Le procedure erano simili a quelle descritte nel nostro studio precedente.

Analisi statistica

Le variabili continue sono state presentate come medie ± deviazioni standard e i dati categorici sono stati presentati come numeri e percentuali. I pazienti con LM ammissibili sono stati raggruppati in base all'esito del trattamento e confrontati con i controlli. Le differenze nei livelli di proteine ​​funzionali nell'urotelio al basale e 3 e 6 mesi dopo l'iniezione di onabotulinumtoxinA sono state analizzate utilizzando un test t di Student accoppiato. Le differenze nell'immunofluorescenza e nel Western blot delle proteine ​​sensoriali tra i gruppi di trattamento riusciti e quelli falliti sono state analizzate utilizzando il test di Kruskal-Wallis. Al fine di chiarire i ruoli delle proteine ​​​​sensoriali uroteliali nell'NDO, è stata eseguita anche l'analisi di correlazione utilizzando la regressione lineare, inclusi VUDS e parametri di disfunzione uroteliale. Tutti i calcoli sono stati eseguiti utilizzando SPSS per Windows versione 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA). Le differenze sono state considerate statisticamente significative se i valori P erano inferiori a 0,05.