慢性脊髄損傷患者における神経原性排尿筋過活動に対するボツリヌス毒素Aの効果

ここ数十年で、脊髄損傷 (SCI) または多発性硬化症による泌尿器科の合併症の管理のための代替方法として、オナボツリヌス毒素 A による神経原性排尿筋過活動 (NDO) の治療が登場しました。 200～300 U のオナボツリヌス毒素 A を排尿筋に注射すると、NDO 患者の収縮性が低下し、膀胱コンプライアンスが改善され、尿禁制が回復します。 しかし、300Uのオナボツリヌス毒素Aの注射後に排尿筋の活動低下が起こり、尿力学および生活の質のパラメータの改善が9ヶ月続いた。 現在、排尿筋への onabotulinumtoxinA の 200 U 単回注射が、NDO の標準治療として推奨されています。 ただし、NDO でのこの投与量の治療期間は、300 U の注射よりも短かった。

OnabotulinumtoxinA は、神経筋および神経腺接合部でのシグナル伝達を阻害することにより、下部尿路の症状を効果的に改善します。 OnabotulinumtoxinA は、シナプトソーム関連タンパク質 25 を切断し、神経伝達物質を含む小胞と神経細胞壁との融合を破壊することによってシグナル伝達を阻害します。 膀胱では、節前および節後の副交感神経からのアセチルコリンの放出が、オナボツリヌス毒素 A の投与後に遮断されます。 この毒素は、NDO 患者の切迫性尿失禁症状の減少に関連する膀胱の求心性活動を調節することもわかっています。 膀胱内の交感神経系に対するオナボツリヌス毒素Aの影響は不明ですが、膀胱頸部の収縮と排尿筋の弛緩をそれぞれ調節するα-およびβ3-アドレナリン受容体（β3-AR）へのノルエピネフリンの放出を抑制する効果があります。

以前の研究では、慢性SCI膀胱患者の接着および結合タンパク質E-カドヘリンおよび小帯閉塞性-1（ZO-1）の発現がそれぞれ減少し、アポトーシスを伴う尿路上皮炎症が増加したことが報告されています.SCI膀胱の尿路上皮の炎症と機能不全もプリン作動性受容体 P2X3、一過性受容体電位バリノイド受容体サブファミリー 1、アデノシン三リン酸、一酸化窒素などの感覚タンパク質の発現を変化させます。 尿路上皮の機能不全はまた、SCI 後の排尿反射の主に求心性神経になる C 線維の興奮性の増加をもたらす可能性があります。 NDO を有するヒトでは、膀胱 P2X2、P2X3、およびムスカリン受容体 M2 および M3 のレベルが、排尿筋オナボツリヌス毒素 A 注射後に減少し、この毒素が排尿反射の感覚腕と運動腕の両方を阻害することによって DO を阻害することが示唆されました。 さらに、β3-AR は、動物およびヒトの膀胱で排尿筋の弛緩を誘導することにより、膀胱での尿の貯蔵を促進することが知られています。 ヒトでは、β3-AR が膀胱の主要な β 受容体サブタイプです。 オナボツリヌス毒素治療前後の SCI 膀胱尿路上皮における β3-AR の変化に関する報告はありません。

オナボツリヌス毒素A注射後、患者は症状が再発するまでの3～6ヶ月間は無症状である可能性があります。 NDO に関する onabotulinumtoxinA のほとんどの研究は動物モデルに由来し、ヒトでの研究はごくわずかです。 現在の研究では、SCI患者にオナボツリヌス毒素を1回注射した後の経時的な尿路上皮機能障害と膀胱尿路上皮の感覚タンパク質発現の変化を調査しました。

材料および方法

NDO と尿失禁を引き起こす慢性 SCI の合計 26 人の患者が、排尿筋への 200 U オナボツリヌス毒素 A の単回注射で治療されました。 すべての患者は、排尿困難の有無にかかわらず尿失禁を呈した。 排尿筋注射を受けた患者では、治療後の排尿管理の可能なモードとして、クリーンな間欠的カテーテル法が提案されました。 現在の研究は、治験審査委員会および仏教慈済総合病院の倫理委員会 (IRB:098-53) によって承認されました。 各患者は、研究の理論的根拠と手順について知らされ、参加するための書面によるインフォームド コンセントが膀胱手順の前に得られました。

ビデオ尿力学研究

すべての患者は、登録前にビデオ尿動態検査 (VUDS) を受けました。 膀胱と尿道の機能障害は、尿道括約筋の協調的または協調不全を伴う DO の存在として分類されました。 尿路感染症の患者は、オナボツリヌス毒素Aの注射が予定される前に適切に治療されました. VUDS の結果は、International Continence Society の推奨に従って解釈されました。 VUDS パラメータには、最大流量 (Qmax)、Qmax での排尿筋排尿圧 (Pdet)、膀胱内圧測定膀胱容量 (CBC)、排尿量 (Vol)、および排尿後の残尿量 (PVR) が含まれます。

オナボツリヌス毒素A注射

すべての患者は、20 mL の生理食塩水中の 200 U のオナボツリヌムトキシン A (BOTOX®、100 U/バイアル、Allergan Inc.、米国アーバイン) を手術室で硬性細胞鏡注射 (22 Fr、Richard Wolf、Knittlingen、Germany) により 40 体に投与されました。三角部を温存する膀胱壁の部位 注射後、尿道フォーリーカテーテルが定期的に挿入され、翌朝、患者が退院する前に取り除かれました。 広域抗生物質は、治療後 3 日間処方されました。

オナボツリヌス毒素 A 注射後、尿管間隆起の約 2 cm 上の後壁で 4 つの膀胱コールド カップ生検を無作為に採取し、膀胱の穿孔を防ぐために膀胱粘膜と粘膜下組織のみを採取しました。紅斑性または炎症性の膀胱粘膜は回避されました。 上皮内癌の可能性を排除するために、各患者から 1 つの膀胱生検標本が病理部門に送られました。 各患者からの残りの 3 つの標本は、さらなる免疫組織化学研究のために、最適な切断温度で液体窒素中に保存されました。

患者のフォローアップと転帰評価

患者は毎月 OPD でフォローアップされ、VUDS と膀胱と排尿状態の評価、および治療の満足度が治療の 3 か月後と 6 か月後に行われました。 CBC がベースライン値から 50% 増加した場合、治療結果は成功したと見なされます。それ以外の場合、結果はその時点で失敗と見なされました。 頻繁な尿意切迫感のないストレス性尿失禁の 10 人の女性患者がコントロールとして使用されました。 すべての対照患者は、VUDS によって膀胱出口閉塞または DO がないことが確認されました。 コントロール膀胱組織は、抗失禁手術中に得られ、SCI患者と同じように処理されました。 前立腺が膀胱出口の閉塞を引き起こし、尿路上皮機能に影響を与える可能性があるため、男性患者は対照として選択されませんでした。

免疫蛍光

SCI 患者およびコントロールからの膀胱組織サンプルを、免疫蛍光法により、尿路上皮 E-カドヘリン (接着タンパク質)、ZO-1 (結合タンパク質)、およびマスト細胞活性化 (トリプターゼ) レベルの変化について調べました。細胞アポトーシスは、ターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニック エンド標識アッセイによって調べた。 これらの手順は、厚さ6μmの組織切片を使用して、以前の研究と同様に実行されました。 膀胱標本をリン酸緩衝生理食塩水（pH 7.4）中の氷冷4％ホルムアルデヒドに1時間浸漬して固定し、15％スクロースを含む氷冷リン酸緩衝生理食塩水で12時間すすいだ。 生検標本は、最適な切断温度の培地に埋め込まれ、-80 ° C で保存されました。 クライオスタットを使用して 8 μm の厚さで標本ごとに 4 つの切片を切り取り、新しいシラン III でコーティングされたガラス スライド (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan) に収集しました。 切片を-20°Cのアセトンで後固定し、ウサギ血清でブロックしました。 切片を抗ヒトE-カドヘリン（BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンノゼ）またはトリプターゼ（米国カリフォルニア州テメキュラのケミコン）一次抗体とともに4°Cで一晩インキュベートしました。 BPS中の0.1％Tween-20で切片をすすいだ後、ウサギ抗マウス結合フルオレセインイソチオシアネート二次抗体（DakoCytomation Denmark A / S、Glostrup、Denmark）を切片に適用し、1時間インキュベートしました。 最後に、切片を 4',6-diamidino-2-phenylindole (Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO、USA) で対比染色しました。 陰性対照には、一次抗体のアイソタイプが含まれていました。 各検体内の 3 つのランダムなホット スポットを使用して、染色強度の平均、最大、範囲、および標準偏差と陽性面積の割合を取得しました。

免疫蛍光の定量化は、最大密度の領域で 4 つの連続した高倍率フィールド (400X) で決定されました。 免疫蛍光 (トリプターゼおよびターミナル デオキシヌクレオチジル トランスフェラーゼ dUTP ニック末端標識) アッセイは、単位面積 (4 μm2) あたりの陽性染色細胞の数を数えることによって定量化され、パーセンテージとして示されています。 E-カドヘリン (蛍光顕微鏡) および ZO-1 (共焦点顕微鏡) 蛍光の強度は、イメージ J を使用して定量化されました。

ウエスタンブロット法を使用して、膀胱粘膜標本の感覚タンパク質のレベルを評価しました。 一次抗体には、P2X3 (1:2000)、内皮型一酸化窒素シンターゼ [eNOS] (1:1000)、M2 (1:1000)、M3 (1:500)、および GAPDH (1:100000; 内部コントロール) が含まれていました。米国カリフォルニア州アーバイン);誘導性 NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher、ロックフォード、イリノイ州、米国)。およびβ3-AR (1:1000; Abcam、ケンブリッジ、英国)。 ロバ抗ヤギ（β3-ARの場合）またはヤギ抗ウサギ（他のすべてのタンパク質の場合）IgG-ホースラディッシュペルオキシダーゼ（1：3000;サンタクルーズバイオテクノロジー、ダラス、テキサス州、米国）二次抗体を使用しました。 ゲル電気泳動後のスキャンされたフィルムは、ゲルドキュメンテーションシステム (Quantity One Version 4.6.2、 Bio-Rad Laboratories、Hemel Hempstead、ハーツ、英国）。 手順は、以前の研究で説明したものと同様でした。

統計分析

連続変数は平均±標準偏差として提示され、カテゴリデータは数値とパーセンテージとして提示されました。 適格なSCI患者は、治療結果に従ってグループ化され、対照と比較されました。 ベースライン時およびオナボツリヌス毒素Ａ注射の３ヶ月後および６ヶ月後の尿路上皮における機能性タンパク質のレベルの差を、対応のあるスチューデントのｔ検定を使用して分析した。 成功した治療群と失敗した治療群の間の感覚タンパク質の免疫蛍光およびウエスタンブロットの違いは、クラスカル・ウォリス検定を使用して分析されました。 NDOにおける尿路上皮感覚タンパク質の役割を明らかにするために、VUDSおよび尿路上皮機能障害パラメーターを含む、線形回帰を使用した相関分析も実行されました。 すべての計算は、SPSS for Windows バージョン 16.0 (SPSS、シカゴ、イリノイ州、米国) を使用して行われました。 P 値が 0.05 未満の場合、差は統計的に有意であると見なされました。