Влияние ботулинического токсина А на нейрогенную гиперактивность детрузора у пациентов с хронической травмой спинного мозга

В последние десятилетия лечение нейрогенной гиперактивности детрузора (НГД) с помощью онаботулотоксина А стало альтернативным методом лечения урологических осложнений, вызванных повреждением спинного мозга (ТСМ) или рассеянным склерозом. Инъекция 200-300 ЕД онаботулотоксина А в мышцу детрузора может снизить сократительную способность, улучшить податливость мочевого пузыря и восстановить удержание мочи у пациентов с НДО. Однако после введения 300 ЕД онаботулотоксина А разовьется гипоактивность детрузора, а улучшение показателей уродинамики и качества жизни продолжалось 9 мес. В настоящее время однократная инъекция 200 ЕД онаботулотоксина А в детрузор рекомендована в качестве стандартного лечения НДО. Однако терапевтическая продолжительность этой дозы при НДО была короче, чем у инъекции 300 ЕД.

Онаботулотоксин А эффективно улучшает симптомы со стороны нижних мочевыводящих путей, ингибируя передачу сигнала в нервно-мышечных и нейрогландулярных соединениях. OnabotulinumtoxinA расщепляет ассоциированный с синаптосомами белок 25 и ингибирует передачу сигнала, нарушая слияние везикул, содержащих нейротрансмиттер, со стенкой нейрона. В мочевом пузыре выделение ацетилхолина из пре- и постганглионарных парасимпатических нервов блокируется после введения онаботулотоксина А. Было также обнаружено, что этот токсин модулирует афферентную активность мочевого пузыря, связанную со снижением императивных позывов и императивных симптомов недержания мочи у пациентов с NDO. Хотя влияние онаботулотоксина А на симпатическую нервную систему в мочевом пузыре неясно, он оказывает ингибирующее действие на выброс норадреналина в α- и β3-адренорецепторы (β3-АР), которые регулируют сокращение шейки мочевого пузыря и расслабление детрузора соответственно.

В предыдущем исследовании сообщалось о снижении экспрессии белков адгезии и соединения E-cadherin и zonula occludens-1 (ZO-1), соответственно, и усилении субуротелиального воспаления с апоптозом у пациентов с хроническим мочевым пузырем ТСМ. Воспаление и дисфункция уротелия в мочевом пузыре ТСМ также могут изменяют экспрессию сенсорных белков, таких как пуринергический рецептор P2X3, подсемейство 1 подсемейства валлиноидных рецепторов временного рецептора, аденозинтрифосфат и оксид азота. Уротелиальная дисфункция также может приводить к повышенной возбудимости С-волокон, которые после ТСМ становятся преимущественно афферентными нервами рефлекса мочеиспускания. У людей с NDO уровни мочевого пузыря P2X2, P2X3 и мускариновых рецепторов M2 и M3 были снижены после инъекции детрузора ботулинического токсина A, что позволяет предположить, что этот токсин ингибирует DO, ингибируя как сенсорные, так и моторные ветви рефлекса мочеиспускания. Кроме того, известно, что β3-АР способствуют накоплению мочи в мочевом пузыре, вызывая расслабление детрузора в мочевом пузыре животных и человека. У человека β3-АР является преобладающим подтипом β-рецепторов в мочевом пузыре. Не было сообщений об изменениях β3-АР в уротелии мочевого пузыря при ТСМ до или после лечения онаботулотоксином.

После инъекции онаботулотоксина А симптомы могут отсутствовать в течение 3-6 месяцев, прежде чем симптомы возобновятся. Большинство исследований онаботулотоксина А в отношении NDO проводятся на животных моделях, и было отмечено лишь несколько исследований на людях. В настоящем исследовании изучались изменения уротелиальной дисфункции и экспрессии сенсорных белков в уротелии мочевого пузыря в зависимости от времени после однократной инъекции онаботулотоксина у пациентов с ТСМ.

Материалы и методы

Всего 26 пациентам с хронической ТСМ, вызывающей НДО и недержание мочи, была проведена однократная инъекция 200 ЕД онаботулотоксина А в мышцу детрузора. У всех пациентов было недержание мочи с затрудненным опорожнением мочевого пузыря или без него. Пациентам, которым вводили инъекции детрузора, в качестве возможного способа управления мочеиспусканием после лечения была предложена чистая прерывистая катетеризация. Текущее исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом и Комитетом по этике буддийской больницы общего профиля Цзы Чи (IRB: 098-53). Каждый пациент был проинформирован об обосновании исследования и процедурах, и письменное информированное согласие на участие было получено до любой процедуры на мочевом пузыре.

Видео уродинамические исследования

Все пациенты перед включением в исследование прошли видеоуродинамическое исследование (ВУДС). Дисфункция мочевого пузыря и уретры классифицировалась как наличие ДО с координированной или диссинергической активностью уретрального сфинктера. Пациенты с инфекцией мочевыводящих путей получали надлежащее лечение до того, как им была назначена инъекция онаботулотоксина А. Результаты ВУДС интерпретировали в соответствии с рекомендациями Международного общества воздержания. Параметры VUDS включали максимальную скорость потока (Qmax), детрузорное давление опорожнения при Qmax (Pdet), цистометрическую емкость мочевого пузыря (CBC), объем опорожнения (Vol) и остаточный объем опорожнения (PVR).

Инъекция онаботулотоксина А

Все пациенты получали 200 ЕД онаботулотоксина А в 20 мл физиологического раствора (БОТОКС®, 100 ЕД/флакон, Allergan Inc., Ирвин, США) в операционной с помощью жесткой цитоскопической инъекции (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Germany) в 40 участки стенки мочевого пузыря, сохраняя треугольник. После инъекции уретральный катетер Фолея обычно вставляли и удаляли на следующее утро перед выпиской пациентов. Назначены антибиотики широкого спектра действия на 3 дня после лечения.

После инъекции онаботулотоксина А были взяты четыре биопсии мочевого пузыря в холодной ванне случайным образом на задней стенке примерно на 2 см выше межмочеточникового гребня, и для предотвращения перфорации мочевого пузыря были взяты только слизистая и подслизистая оболочка мочевого пузыря; любой эритематозной или воспалительной слизистой оболочки мочевого пузыря избегали. Один образец биопсии мочевого пузыря от каждого пациента был отправлен в отделение патологии, чтобы исключить возможность рака in situ. Остальные три образца от каждого пациента хранились при оптимальной температуре резки и в жидком азоте для дальнейших иммуногистохимических исследований.

Наблюдение за пациентом и оценка результатов

Пациентов осматривали ежемесячно при ОПД, а через 3 и 6 месяцев после лечения проводили ВУДС, оценку состояния мочевого пузыря и мочеиспускания и удовлетворенность лечением. Если ОАК повышался на 50% от исходного значения, исход лечения считался успешным; в противном случае результат считался неудачным на тот момент времени. Десять пациенток со стрессовым недержанием мочи без частых императивных позывов служили контролем. Все контрольные пациенты были подтверждены отсутствием инфравезикальной обструкции или НО с помощью ВУДС. Контрольная ткань мочевого пузыря была получена во время операции по поводу недержания мочи и обработана так же, как и у пациентов с ТСМ. Пациенты мужского пола не были выбраны в качестве контроля, поскольку предстательная железа может вызывать обструкцию выходного отверстия мочевого пузыря и влиять на функцию уротелия.

Иммунофлуоресценция

Образцы ткани мочевого пузыря от пациентов с ТСМ и контрольной группы исследовали на предмет изменений уровней уротелиального Е-кадгерина (адгезивного белка), ZO-1 (соединительного белка) и активации тучных клеток (триптазы) с помощью иммунофлуоресценции; клеточный апоптоз исследовали с помощью анализа мечения концов терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP. Эти процедуры проводились так же, как и в нашем предыдущем исследовании, с использованием срезов ткани толщиной 6 мкм. Образцы мочевого пузыря погружали и фиксировали в течение 1 ч в ледяном 4% формальдегиде в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4), затем промывали ледяным фосфатно-солевым буфером, содержащим 15% сахарозы, в течение 12 часов. Образцы биоптатов заливали в среду с оптимальной температурой резки и хранили при температуре -80 °С. Четыре среза на образец вырезали с помощью криостата толщиной 8 мкм и собирали на новые предметные стекла, покрытые силаном III (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Токио, Япония). Срезы постфиксировали в ацетоне при -20°С и блокировали кроличьей сывороткой. Срезы инкубировали в течение ночи при 4 °C с первичными антителами против Е-кадгерина человека (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) или триптазы (Chemicon, Темекула, Калифорния, США). После промывания срезов 0,1% Tween-20 в BPS наносили кроличьи антимышиные конъюгированные вторичные антитела флуоресцеинизотиоцианата (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Дания) и инкубировали на срезах в течение 1 часа. Наконец, срезы контрастно окрашивали 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (Sigma Chemical Co., Сент-Луис, Миссури, США). Отрицательные контроли включали изотип первичного антитела. Мы получили среднее, максимальное значение, диапазон и стандартное отклонение интенсивности окрашивания и измерения процентной доли положительной площади, используя три случайных горячих точки в каждом образце.

Количественную оценку иммунофлуоресценции определяли в четырех последовательных полях высокой мощности (400Х) в области с наибольшей плотностью. Анализы иммунофлуоресценции (триптаза и терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза dUTP с мечением концов) количественно определяли путем подсчета количества положительно окрашенных клеток на единицу площади (4 мкм2) и отображали в процентах. Интенсивность флуоресценции Е-кадгерина (флуоресцентная микроскопия) и ZO-1 (конфокальная микроскопия) количественно определяли с использованием изображения J.

Вестерн-блоттинг использовали для оценки уровней сенсорных белков в образцах слизистой оболочки мочевого пузыря. Первичные антитела включали P2X3 (1:2000), эндотелиальную синтазу оксида азота [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) и GAPDH (1:100000; внутренний контроль) от GeneTex ( Ирвин, Калифорния, США); индуцибельная NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Рокфорд, Иллинойс, США); и β3-AR (1:1000; Abcam, Кембридж, Великобритания). Использовали ослиные антикозьи (для β3-AR) или козлиные антикроличьи (для всех других белков) IgG-пероксидазы хрена (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) вторичные антитела. Отсканированную пленку после гель-электрофореза количественно оценивали с использованием системы документирования геля (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Хемел-Хемпстед, Хертс, Великобритания). Процедуры были аналогичны описанным в нашем предыдущем исследовании.

Статистический анализ

Непрерывные переменные были представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, а категориальные данные были представлены как числа и проценты. Подходящие пациенты с ТСМ были сгруппированы в соответствии с результатами лечения и по сравнению с контрольной группой. Различия в уровне функциональных белков в уротелии исходно, а также через 3 и 6 мес после введения онаботулотоксина А анализировали с помощью парного t-критерия Стьюдента. Различия в иммунофлуоресценции и Вестерн-блоттинге сенсорных белков между успешными и неудачными группами лечения анализировали с использованием теста Крускала-Уоллиса. Для выяснения роли уротелиальных сенсорных белков в NDO также был проведен корреляционный анализ с использованием линейной регрессии, включая параметры ВУДС и уротелиальной дисфункции. Все расчеты проводились с использованием SPSS для Windows версии 16.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США). Различия считались статистически значимыми, если значения P были менее 0,05.