Wirkung von Botulinumtoxin A auf die neurogene Detrusor-Überaktivität bei Patienten mit chronischer Rückenmarksverletzung

In den letzten Jahrzehnten hat sich die Behandlung der neurogenen Detrusorüberaktivität (NDO) mit Onabotulinumtoxin A als alternative Methode zur Behandlung urologischer Komplikationen aufgrund von Rückenmarksverletzungen (SCI) oder Multipler Sklerose herauskristallisiert. Die Injektion von 200–300 E OnabotulinumtoxinA in den Detrusormuskel kann die Kontraktilität reduzieren, die Blasencompliance verbessern und die Harnkontinenz bei Patienten mit NDO wiederherstellen. Allerdings entwickelt sich nach der Injektion von 300 E Onabotulinumtoxin A eine Detrusorschwäche, und die Verbesserung der urodynamischen und Lebensqualitätsparameter hielt 9 Monate an. Derzeit wird eine Einzelinjektion von 200 E Onabotulinumtoxin A in den Detrusor als Standardbehandlung für NDO empfohlen. Die therapeutische Dauer dieser Dosierung auf NDO war jedoch kürzer als die einer 300 E-Injektion.

OnabotulinumtoxinA verbessert wirksam die Symptome der unteren Harnwege, indem es die Signalübertragung an den neuromuskulären und neuroglandulären Verbindungen hemmt. OnabotulinumtoxinA spaltet Synaptosomen-assoziiertes Protein 25 und hemmt die Signalübertragung, indem es die Fusion von Neurotransmitter-enthaltenden Vesikeln mit der Nervenwand stört. In der Harnblase wird die Freisetzung von Acetylcholin sowohl aus den prä- als auch aus den postganglionären parasympathischen Nerven nach der Verabreichung von Onabotulinumtoxin A blockiert. Es wurde auch festgestellt, dass dieses Toxin die afferente Aktivität der Blase moduliert, die mit reduziertem Harndrang und Symptomen der Harninkontinenz bei NDO-Patienten verbunden ist. Obwohl die Wirkung von OnabotulinumtoxinA auf das sympathische Nervensystem in der Harnblase unklar ist, hat es eine hemmende Wirkung auf die Freisetzung von Norepinephrin an α- und β3-Adrenorezeptoren (β3-ARs), die die Kontraktion des Blasenhalses bzw. die Entspannung des Detrusors regulieren.

Eine frühere Studie berichtete über eine verringerte Expression der Adhäsions- und Verbindungsproteine ​​E-Cadherin bzw. Zonula occludens-1 (ZO-1) und eine verstärkte suburotheliale Entzündung mit Apoptose bei Patienten mit chronischer SCI-Blase. Die urotheliale Entzündung und Dysfunktion in SCI-Blasen könnte ebenfalls auftreten die sensorische Proteinexpression verändern, wie z. B. beim purinergen Rezeptor P2X3, transientem Rezeptorpotenzial der Vallinoidrezeptor-Unterfamilie 1, Adenosintriphosphat und Stickoxid. Eine urotheliale Dysfunktion kann auch zu einer erhöhten Erregbarkeit der C-Fasern führen, die nach SCI überwiegend zu afferenten Nerven des Miktionsreflexes werden. Bei Menschen mit NDO waren die Werte der Blasen-P2X2-, P2X3- und Muscarinrezeptoren M2 und M3 nach der Detrusor-Onabotulinumtoxin-A-Injektion reduziert, was darauf hindeutet, dass dieses Toxin DO hemmt, indem es sowohl die sensorischen als auch die motorischen Arme des Miktionsreflexes hemmt. Darüber hinaus ist bekannt, dass β3-ARs die Urinspeicherung in der Blase fördern, indem sie eine Detrusor-Relaxation in tierischen und menschlichen Blasen induzieren. Beim Menschen ist β3-AR der vorherrschende β-Rezeptor-Subtyp in der Harnblase. Es liegen keine Berichte über β3-AR-Veränderungen im SCI-Blasenurothel vor oder nach der Behandlung mit Onabotulinumtoxin vor.

Nach der Injektion von Onabotulinumtoxin A können Patienten für einen Zeitraum von 3-6 Monaten symptomfrei sein, bevor die Symptome wieder auftreten. Die meisten Studien zu OnabotulinumtoxinA auf NDO stammen aus Tiermodellen, und es wurden nur wenige Studien am Menschen festgestellt. Die aktuelle Studie untersuchte Veränderungen der urothelialen Dysfunktion und der sensorischen Proteinexpression im Blasen-Urothel mit der Zeit nach einer einzigen Onabotulinumtoxin-Injektion bei SCI-Patienten.

Materialen und Methoden

Insgesamt 26 Patienten mit chronischer Rückenmarksverletzung, die NDO und Harninkontinenz verursacht, wurden mit einer einzigen Injektion von 200 E Onabotulinumtoxin A in den Detrusormuskel behandelt. Alle Patienten stellten sich mit Harninkontinenz mit oder ohne erschwerter Blasenentleerung vor. Bei Patienten, die Detrusor-Injektionen erhielten, wurde eine saubere intermittierende Katheterisierung als mögliche Methode des Harnmanagements nach der Behandlung vorgeschlagen. Die aktuelle Studie wurde vom Institutional Review Board und der Ethikkommission des Buddhist Tzu Chi General Hospital (IRB:098-53) genehmigt. Jeder Patient wurde über die Gründe und Verfahren der Studie informiert, und vor jedem Blaseneingriff wurde eine schriftliche Einverständniserklärung zur Teilnahme eingeholt.

Video-urodynamische Studien

Alle Patienten erhielten vor ihrer Aufnahme eine Video-Urodynamik-Studie (VUDS). Blasen- und Harnröhrenfunktionsstörungen wurden als Vorhandensein von DO mit koordinierter oder dyssynerger Aktivität des Harnröhrenschließmuskels klassifiziert. Patienten mit Harnwegsinfektionen wurden angemessen behandelt, bevor bei ihnen eine OnabotulinumtoxinA-Injektion geplant war. Die VUDS-Ergebnisse wurden gemäß den Empfehlungen der International Continence Society interpretiert. Zu den VUDS-Parametern gehörten die maximale Flussrate (Qmax), der Detrusor-Entleerungsdruck bei Qmax (Pdet), die zystometrische Blasenkapazität (CBC), das entleerte Volumen (Vol) und das Restvolumen nach der Entleerung (PVR).

Injektion von OnabotulinumtoxinA

Alle Patienten erhielten 200 E OnabotulinumtoxinA in 20 ml normaler Kochsalzlösung (BOTOX®, 100 E/Fläschchen, Allergan Inc., Irvine, USA) im Operationssaal durch starre zytoskopische Injektion (22 Fr, Richard Wolf, Knittlingen, Deutschland) in 40 Stellen der Blasenwand unter Aussparung des Trigonus Nach der Injektion wurde routinemäßig ein urethraler Foley-Katheter eingeführt und am nächsten Morgen entfernt, bevor die Patienten entlassen wurden. Breitbandantibiotika wurden für 3 Tage nach der Behandlung verschrieben.

Nach der Onabotulinumtoxin A-Injektion wurden vier Blasen-Cold-Cup-Biopsien nach dem Zufallsprinzip an der hinteren Wand etwa 2 cm über dem interureterischen Kamm entnommen, und nur die Blasenschleimhaut und -submukosa wurden entnommen, um eine Blasenperforation zu verhindern; erythematöse oder entzündliche Blasenschleimhaut wurden vermieden. Eine Blasenbiopsieprobe von jedem Patienten wurde an die Pathologieabteilung geschickt, um die Möglichkeit eines Karzinoms in situ auszuschließen. Die verbleibenden drei Proben von jedem Patienten wurden bei optimaler Schnitttemperatur und in flüssigem Stickstoff für weitere immunhistochemische Studien gelagert.

Patientennachsorge und Ergebnisbewertung

Die Patienten wurden monatlich bei OPD nachbeobachtet, und 3 und 6 Monate nach der Behandlung wurden VUDS und die Beurteilung der Blasen- und Miktionsbedingungen sowie der Zufriedenheit mit der Behandlung durchgeführt. Wenn das CBC gegenüber dem Ausgangswert um 50 % anstieg, wurde das Behandlungsergebnis als erfolgreich angesehen; Andernfalls wurde das Ergebnis zu diesem Zeitpunkt als Fehlschlag betrachtet. Als Kontrollgruppe dienten zehn Patientinnen mit stressbedingter Harninkontinenz ohne häufigen Harndrang. Alle Kontrollpatienten wurden durch VUDS als frei von Blasenauslassobstruktion oder DO bestätigt. Kontroll-Blasengewebe wurde während einer Anti-Inkontinenz-Operation entnommen und wie SCI-Patienten verarbeitet. Männliche Patienten wurden nicht als Kontrollen ausgewählt, da die Prostata eine Obstruktion des Blasenausgangs verursachen und die Urothelfunktion beeinträchtigen könnte.

Immunfluoreszenz

Blasengewebeproben von SCI-Patienten und Kontrollpersonen wurden mittels Immunfluoreszenz auf Veränderungen der Urothelspiegel von E-Cadherin (adhäsives Protein), ZO-1 (Verbindungsprotein) und Mastzellaktivierung (Tryptase) untersucht; zelluläre Apoptose wurde durch Terminal-Desoxynukleotidyl-Transferase-dUTP-Nick-Endmarkierungsassay untersucht. Diese Verfahren wurden ähnlich wie in unserer vorherigen Studie mit 6 μm dicken Gewebeschnitten durchgeführt. Harnblasenproben wurden eingetaucht und für 1 h in eiskaltem 4 % Formaldehyd in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) fixiert, dann mit eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung, die 15 % Saccharose enthielt, für 12 h gespült. Biopsieproben wurden in Medium mit optimaler Schnitttemperatur eingebettet und bei -80 °C gelagert. Vier Schnitte pro Probe wurden unter Verwendung eines Kryostaten mit einer Dicke von 8 &mgr;m geschnitten und auf neuen Silan-III-beschichteten Glasobjektträgern (Muto Pure Chemicals Co., Ltd, Tokyo, Japan) gesammelt. Die Schnitte wurden in Aceton bei –20°C nachfixiert und mit Kaninchenserum blockiert. Die Schnitte wurden über Nacht bei 4 °C mit primären Antikörpern gegen humanes E-Cadherin (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) oder Tryptase (Chemicon, Temecula, CA, USA) inkubiert. Nach dem Spülen der Schnitte mit 0,1 % Tween-20 in BPS wurden Kaninchen-anti-Maus-konjugierte Fluoresceinisothiocyanat-Sekundärantikörper (DakoCytomation Denmark A/S, Glostrup, Dänemark) aufgebracht und auf den Schnitten für 1 h inkubiert. Schließlich wurden die Schnitte mit 4',6-Diamidino-2-phenylindol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA) gegengefärbt. Negativkontrollen umfassten den Isotyp des primären Antikörpers. Wir erhielten den Mittelwert, das Maximum, den Bereich und die Standardabweichung der Färbungsintensität und die Messungen der prozentualen positiven Fläche unter Verwendung von drei zufälligen Hotspots innerhalb jeder Probe.

Die Immunfluoreszenzquantifizierung wurde in vier aufeinanderfolgenden Hochleistungsfeldern (400X) im Bereich mit der größten Dichte bestimmt. Immunfluoreszenz-Assays (Tryptase und terminale Desoxynukleotidyl-Transferase dUTP-Nick-End-Markierung) wurden durch Zählen der Anzahl positiv gefärbter Zellen pro Flächeneinheit (4 μm2) quantifiziert und sind als Prozentsätze dargestellt. Die Intensität der Fluoreszenz von E-Cadherin (Fluoreszenzmikroskopie) und ZO-1 (konfokale Mikroskopie) wurde mit Image J quantifiziert.

Western Blotting wurde verwendet, um die Konzentrationen von sensorischen Proteinen in Blasenschleimhautproben zu bestimmen. Zu den primären Antikörpern gehörten P2X3 (1:2000), endotheliale Stickoxidsynthase [eNOS] (1:1000), M2 (1:1000), M3 (1:500) und GAPDH (1:100000; interne Kontrolle) von GeneTex ( Irvine, CA, USA); induzierbare NOS [iNOS] (1:1500; ThermoFisher, Rockford, IL, USA); und β3-AR (1:1000; Abcam, Cambridge, UK). Es wurden sekundäre IgG-Meerrettich-Peroxidase-Antikörper (1:3000; Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) von Esel-Anti-Ziege (für β3-AR) oder Ziege-Anti-Kaninchen (für alle anderen Proteine) verwendet. Der gescannte Film nach der Gelelektrophorese wurde mit einem Geldokumentationssystem (Quantity One Version 4.6.2, Bio-Rad Laboratories, Hemel Hempstead, Herts, UK). Die Verfahren ähnelten denen, die in unserer vorherigen Studie beschrieben wurden.

Statistische Analyse

Kontinuierliche Variablen wurden als Mittelwerte ± Standardabweichungen dargestellt, und kategoriale Daten wurden als Zahlen und Prozentsätze dargestellt. Geeignete SCI-Patienten wurden nach Behandlungsergebnis gruppiert und mit Kontrollen verglichen. Unterschiede in den Spiegeln funktioneller Proteine ​​im Urothel zu Studienbeginn sowie 3 und 6 Monate nach der OnabotulinumtoxinA-Injektion wurden mit einem gepaarten Student's t-Test analysiert. Unter Verwendung des Kruskal-Wallis-Tests wurden Unterschiede in der Immunfluoreszenz und im Western Blot von sensorischen Proteinen zwischen erfolgreichen und fehlgeschlagenen Behandlungsgruppen analysiert. Um die Rolle der urothelialen sensorischen Proteine ​​bei NDO zu klären, wurde auch eine Korrelationsanalyse unter Verwendung linearer Regression durchgeführt, einschließlich VUDS und urotheliale Dysfunktionsparameter. Alle Berechnungen wurden mit SPSS für Windows Version 16.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) durchgeführt. Unterschiede wurden als statistisch signifikant angesehen, wenn die P-Werte kleiner als 0,05 waren.