조기 위암 및 위선종 환자의 유전자 염기서열 분석의 임상적 적용

tmor 샘플의 적합성

: H&E 염색된 슬라이드와 비교하여 4 μm 두께의 염색되지 않은 절편에서 종양 부위(>60%)를 현미경으로 해부하고, genomic DNA를 Qiagen DNA FFPE Tissue Kit(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 추출하였다. 제조업체의 지침. 추출 후 분광광도계(ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 농도와 260/280 및 260/230 nm 비율을 측정했습니다. 그런 다음 각 샘플을 Qubit 형광 측정기(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA)로 정량화했습니다. Qubit 형광계로 측정한 10ng 이상의 게놈 DNA 샘플을 AmpliSeq 라이브러리 준비에 적용했습니다. "druggable" CNV를 식별하기 위해 21개 유전자 nCounter CNV 분석을 사용했습니다.

종양 분자 프로파일링 방법

• Ion Torrent PGM Amplieq Cancer Panel 2.0 : Ion AmpliSep Cancer Panel V2(Ion Torrent)를 사용하여 문헌 검토를 통해 선별된 빈번한 체세포 돌연변이를 검출합니다. 그것은 50개의 일반적으로 돌연변이된 발암 유전자 및 종양 억제 유전자에서 285개의 돌연변이를 검사합니다. 먼저, 각 89개의 FFPE 종양 샘플에서 추출한 10ng의 DNA는 Ion AmpliSepCancer Primer Pool 및 AmpliSepKit 시약(Life Technologies)을 사용하여 단일 튜브, 다중 PCR 증폭을 거쳤습니다. FuPa Preagent로 생성된 앰플리콘을 처리하면 프라이머를 부분적으로 분해하고 앰플리콘을 인산화합니다. . 앰플리콘의 인산화는 이온 답터에 결찰되고 정화됩니다. 바코드 라이브러리 준비를 위해 Ion XpressTM 라이브러리 키트에서 바코드 어댑터를 대체합니다. 결찰된 DNA는 어댑터와 앰플리콘 사이의 연결을 완료하고 dowmstream 템플릿 트레퍼레이션을 위한 충분한 물질을 생성하기 위해 닉 번역 및 증폭을 거칩니다. 0.6 및 1.2 비드-시료 부피 비율에서 2회에 걸친 Agencourt® AMPure® XP Reagent 결합은 입력 DNA를 제거하고 통합되지 않은 프라이머는 앰플리콘을 형성합니다. 최종 라이브러리 분자의 크기는 125-300bp입니다. 그런 다음 자동화된 템플릿 준비를 위해 라이브러리를 Ion OneTouchTM 시스템으로 전송합니다. 제조업체의 지침에 따라 Ion PGMTM 시퀀서에서 시퀀싱을 수행합니다. 우리는 자동 데이터 분석을 위해 IonTorrent 소프트웨어를 사용합니다.
• nCounter copy Number Variation CodeSets: 이전 연구에서 약술한 대로 21개 유전자 CNV 분석법을 맞춤 설계했습니다. 21개의 유전자에는 AURAKA, CCND1, CCNE1, CDK4, CDK6, CDNK1A, CDNK2A, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, IGFR1R, KLF5, KRAS, MDM2, MET, MITF, MYC, PIK3CA 및 TNIK가 포함되었습니다. CNV 검출을 위해 nCounter Copy Number Variation CodeSets를 200ng의 정제된 게놈 DNA와 함께 사용했습니다. DNA는 AluI 소화를 통해 단편화되었고 95°C에서 변성되었습니다. 단편화된 DNA를 nCounter Cancer CN 분석 키트(Nanostring Technologies)의 21개 유전자 코드세트와 65°C에서 18시간 동안 혼성화하고 제조업체의 지침에 따라 처리했습니다. nCounter 디지털 분석기는 리포터 프로브의 신호를 세고 표로 만들었습니다. NanoString의 nSolver 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화된 데이터를 분석했습니다.

• 면역조직화학

  : RET, ATM, PD-L1, FGFR2, MLH, EGFR, ALK, ROS, TRKA. MET, HER2, PTEN 손실(선택된 경우 EGFR, CCNEI)

• 암 스캔

  : 삼성게놈연구소 표적 딥시퀀싱

  : Illumina HiSeq2000/2500 기반, MiSeq NGS 표적 시퀀싱

• ASFA™ 스포터