Aplicação Clínica do Sequenciamento Genético de Pacientes com Câncer Gástrico Inicial e Adenoma Gástrico

Adequação de amostras tmor

: As áreas tumorais (> 60%) são dissecadas sob microscopia de seções não coradas de 4 μm de espessura por comparação com uma lâmina corada com H&E, e o DNA genômico foi extraído usando um Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com o instruções do fabricante. Após a extração, medimos as concentrações e as proporções de 260/280 e 260/230 nm usando um espectrofotômetro (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, EUA). Cada amostra foi então quantificada com um fluorômetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA). Amostras de DNA genômico com mais de 10 ng medidas pelo fluorômetro Qubit foram submetidas à preparação da biblioteca AmpliSeq. Para identificar CNVs "drogáveis", usamos um ensaio nCounter CNV de 21 genes.

Método de perfil molecular tumoral

• Ion Torrent PGM Amplieq Cancer Panel 2.0: Usamos o Ion AmpliSep Cancer Panel V2 (Ion Torrent) para detectar mutações somáticas frequentes que foram selecionadas com base na revisão da literatura. Ele examina 285 mutações em 50 oncogenes comumente mutados e genes supressores de tumor. Primeiro, 10 ng de DNA de cada 89 amostras de tumor FFPE foram submetidos a amplificação de PCR multiplex de tubo único usando o Ion AmpliSepCancer Primer Pool e os reagentes AmpliSepKit (Life Technologies). O tratamento dos amplicons resultantes com FuPa Preagent digeriu parcialmente os primers e fosforilou os amplicons . O fosforilado dos amplicons é ligado a adaptadores de íons e purificado. Para a preparação da biblioteca com código de barras, substituímos os adaptadores de código de barras do Ion XpressTM Library Kit. O DNA ligado passa por tradução de corte e amplificação para completar a ligação entre adaptadores e amplicons e para gerar material suficiente para a treparação do molde a jusante. Duas rodadas de ligação do reagente Agencourt® AMPure® XP em proporções de 0,6 e 1,2 grânulos/volume de amostra removeram o DNA de entrada e os primers não incorporados dos amplicons. As moléculas da biblioteca final têm 125-300 pb de tamanho. Em seguida, transferimos as bibliotecas para o sistema Ion OneTouchTM para preparação automatizada de modelos. O sequenciamento é realizado no sequenciador Ion PGMTM de acordo com as instruções do fabricante. Usamos o software IonTorrent para análise automatizada de dados.
• nCounter copy Number Variation CodeSets: Desenvolvemos um ensaio de CNV de 21 genes de forma personalizada, conforme descrito em um estudo anterior. Os 21 genes incluíam AURAKA, CCND1, CCNE1, CDK4, CDK6, CDNK1A, CDNK2A, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, IGFR1R, KLF5, KRAS, MDM2, MET, MITF, MYC, PIK3CA e TNIK. Para a detecção de CNVs, os conjuntos de códigos de variação do número de cópias nCounter foram usados ​​com 200 ng de DNA genômico purificado. O DNA foi fragmentado via digestão com AluI e desnaturado a 95°C. O DNA fragmentado foi hibridizado com o codeset de 21 genes no nCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) por 18 h a 65°C e processado de acordo com as instruções do fabricante. O nCounter Digital Analyzer contou e tabulou os sinais das sondas repórter. Os dados quantificados foram analisados ​​usando o software de análise nSolver da NanoString.

• imuno-histoquímica

  : RET, ATM, PD-L1, FGFR2, MLH, EGFR, ALK, ROS, TRKA. MET, HER2, perda de PTEN (EGFR, CCNEI em casos selecionados)

• Exame de câncer

  : sequenciamento profundo direcionado no Samsung Genome Institute

  : Sequenciamento direcionado baseado em Illumina HiSeq2000/2500, MiSeq NGS

• Observador ASFA™