Application clinique du séquençage génétique des patients atteints d'un cancer gastrique précoce et d'un adénome gastrique

Adéquation des échantillons de tumeur

: Les zones tumorales (> 60 %) sont disséquées au microscope à partir de coupes non colorées de 4 μm d'épaisseur par comparaison avec une lame colorée H&E, et l'ADN génomique a été extrait à l'aide d'un kit Qiagen DNA FFPE Tissue (Qiagen, Hilden, Allemagne) selon les instruction du fabricant. Après extraction, nous avons mesuré les concentrations et les rapports 260/280 et 260/230 nm à l'aide d'un spectrophotomètre (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, USA). Chaque échantillon a ensuite été quantifié avec un fluorimètre Qubit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Des échantillons d'ADN génomique avec plus de 10 ng mesurés par le fluoromètre Qubit ont été soumis à la préparation de la bibliothèque AmpliSeq. Pour identifier les CNV "médicamentables", nous avons utilisé un test de 21 gènes nCounter CNV.

Méthode de profilage moléculaire tumoral

• Ion Torrent PGM Amplieq Cancer Panel 2.0 : Nous utilisons le Ion AmpliSep Cancer Panel V2 (Ion Torrent) pour détecter les mutations somatiques fréquentes qui ont été sélectionnées sur la base d'une revue de la littérature. Il examine 285 mutations dans 50 oncogènes et gènes suppresseurs de tumeurs couramment mutés. Tout d'abord, 10 ng d'ADN de chacun des 89 échantillons de tumeurs FFPE ont subi une amplification PCR multiplex à tube unique à l'aide du pool d'amorces Ion AmpliSepCancer et des réactifs AmpliSepKit (Life Technologies). . Le phosphorylate des amplicons est ligaturé à des dapters ioniques et purifié. Pour la préparation de bibliothèques à code-barres, nous remplaçons les adaptateurs à code-barres du kit de bibliothèque Ion XpressTM. L'ADN ligaturé subit une traduction de coupure et une amplification pour compléter la liaison entre les adaptateurs et les amplicons et pour générer suffisamment de matériel pour la préparation de la matrice en aval. Deux cycles de liaison du réactif Agencourt® AMPure® XP à des rapports volumiques billes/échantillon de 0,6 et 1,2 ont éliminé l'ADN d'entrée et les amorces non incorporées des amplicons. Les molécules de la bibliothèque finale ont une taille de 125 à 300 pb. Nous transférons ensuite les bibliothèques au système Ion OneTouchTM pour la préparation automatisée des modèles. Le séquençage est effectué sur le séquenceur Ion PGMTM selon les instructions du fabricant. Nous utilisons le logiciel IonTorrent pour l'analyse automatisée des données.
• nCounter copie Number Variation CodeSets : nous avons conçu sur mesure un test CNV de 21 gènes, comme indiqué dans une étude précédente. Les 21 gènes comprenaient AURAKA, CCND1, CCNE1, CDK4, CDK6, CDNK1A, CDNK2A, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, IGFR1R, KLF5, KRAS, MDM2, MET, MITF, MYC, PIK3CA et TNIK. Pour la détection des CNV, des ensembles de codes de variation du nombre de copies nCounter ont été utilisés avec 200 ng d'ADN génomique purifié. L'ADN a été fragmenté par digestion par Alul et dénaturé à 95°C. L'ADN fragmenté a été hybridé avec le jeu de codes de 21 gènes dans le kit de test nCounter Cancer CN (Nanostring Technologies) pendant 18 h à 65 ° C et traité conformément aux instructions du fabricant. L'analyseur numérique nCounter a compté et tabulé les signaux des sondes rapporteurs. Les données quantifiées ont été analysées à l'aide du logiciel d'analyse nSolver de NanoString.

• Immunohistochimie

  : RET, ATM, PD-L1, FGFR2, MLH, EGFR, ALK, ROS, TRKA. MET, HER2, perte de PTEN (EGFR, CCNEI dans certains cas)

• Analyse du cancer

  : séquençage approfondi ciblé au Samsung Genome Institute

  : Séquençage ciblé MiSeq NGS basé sur Illumina HiSeq2000/2500

• Spotter ASFA™