Клиническое применение генетического секвенирования пациентов с ранним раком желудка и аденомой желудка

Пригодность образцов tmor

: Области опухоли (> 60%) вырезали под микроскопом из неокрашенных срезов толщиной 4 мкм для сравнения с предметным стеклом, окрашенным H&E, и геномную ДНК экстрагировали с использованием набора Qiagen DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany) в соответствии с инструкции производителя. После экстракции мы измерили концентрации и соотношения 260/280 и 260/230 нм с помощью спектрофотометра (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, Массачусетс, США). Затем каждый образец был количественно определен с помощью флуорометра Qubit (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Образцы геномной ДНК с массой более 10 нг, измеренной флуорометром Qubit, подвергали подготовке библиотеки AmpliSeq. Чтобы идентифицировать «лекарственные» CNV, мы использовали анализ nCounter CNV с 21 геном.

Метод молекулярного профилирования опухоли

• Ion Torrent PGM Amplieq Cancer Panel 2.0: Мы используем Ion AmpliSep Cancer Panel V2 (Ion Torrent) для обнаружения частых соматических мутаций, которые были выбраны на основе обзора литературы. Он исследует 285 мутаций в 50 часто мутирующих онкогенах и генах-супрессорах опухолей. Во-первых, 10 нг ДНК из каждых 89 образцов опухоли FFPE подвергали мультиплексной ПЦР-амплификации в одной пробирке с использованием пула праймеров Ion AmpliSepCancer и реагентов AmpliSepKit (Life Technologies). Обработка полученных ампликонов преагентом FuPa частично расщепляет праймеры и фосфорилирует ампликоны. . Фосфорилированные ампликоны лигируют с ионными адаптерами и очищают. Для подготовки библиотеки штрих-кодов мы заменяем адаптеры штрих-кода из комплекта библиотеки Ion XpressTM. Лигированная ДНК подвергается ник-трансляции и амплификации для завершения связи между адаптерами и ампликонами и получения достаточного количества материала для подготовки матрицы ниже по течению. Два раунда связывания реагента Agencourt® AMPure® XP при объемном отношении гранул к объему образца 0,6 и 1,2 удалили введенную ДНК, а невключенные праймеры сформировали ампликоны. Молекулы конечной библиотеки имеют размер 125-300 п.н. Затем мы передаем библиотеки в систему Ion OneTouchTM для автоматической подготовки шаблонов. Секвенирование выполняется на секвенаторе Ion PGM™ в соответствии с инструкциями производителя. Мы используем программное обеспечение IonTorrent для автоматического анализа данных.
• Наборы кодов вариации числа копий nCounter: мы специально разработали анализ CNV с 21 геном, как описано в предыдущем исследовании. 21 ген включал AURAKA, CCND1, CCNE1, CDK4, CDK6, CDNK1A, CDNK2A, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, IGFR1R, KLF5, KRAS, MDM2, MET, MITF, MYC, PIK3CA и TNIK. Для обнаружения CNV использовали наборы кодов nCounter Copy Number Variation CodeSets с 200 нг очищенной геномной ДНК. ДНК фрагментировали с помощью расщепления AluI и денатурировали при 95°C. Фрагментированную ДНК гибридизовали с набором кодов 21 гена в наборе nCounter Cancer CN Assay Kit (Nanostring Technologies) в течение 18 ч при 65°C и обрабатывали в соответствии с инструкциями производителя. Цифровой анализатор nCounter подсчитывал и табулировал сигналы репортерных зондов. Количественные данные были проанализированы с использованием программного обеспечения для анализа NanoString nSolver.

• Иммуногистохимия

  : РЕТ, АТМ, PD-L1, FGFR2, MLH, EGFR, ALK, ROS, TRKA. Потеря MET, HER2, PTEN (EGFR, CNEI в отдельных случаях)

• Сканирование рака

  : целевое глубокое секвенирование в Samsung Genome Institute

  : Целевое секвенирование MiSeq NGS на основе Illumina HiSeq2000/2500

• Споттер ASFA™