Aplicación clínica de la secuenciación genética de pacientes con cáncer gástrico temprano y adenoma gástrico

Idoneidad de las muestras de tmor

: Las áreas tumorales (> 60 %) se diseccionan bajo microscopía a partir de secciones no teñidas de 4 μm de espesor en comparación con un portaobjetos teñido con H&E, y el ADN genómico se extrajo utilizando un kit de tejido Qiagen DNA FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania) de acuerdo con la Instrucciones del fabricante. Después de la extracción, medimos las concentraciones y las proporciones de 260/280 y 260/230 nm usando un espectrofotómetro (ND1000, Nanodrop Technologies, ThermoFisher Scientific, MA, EE. UU.). Luego, cada muestra se cuantificó con un fluorómetro Qubit (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.). Las muestras de ADN genómico con más de 10 ng medidas con el fluorómetro Qubit se sometieron a la preparación de la biblioteca AmpliSeq. Para identificar las CNV "medicables", utilizamos un ensayo de CNV nCounter de 21 genes.

Método de perfilado molecular tumoral

• Ion Torrent PGM Amplieq Cancer Panel 2.0: utilizamos el Ion AmpliSep Cancer Panel V2 (Ion Torrent) para detectar mutaciones somáticas frecuentes que se seleccionaron en función de la revisión de la literatura. Examina 285 mutaciones en 50 oncogenes y genes supresores de tumores comúnmente mutados. En primer lugar, 10 ng de ADN de cada 89 muestras tumorales FFPE se sometieron a una amplificación por PCR multiplex en un solo tubo utilizando Ion AmpliSepCancer Primer Pool y los reactivos AmpliSepKit (Life Technologies). El tratamiento de los amplicones resultantes con FuPa Preagent digirió parcialmente los cebadores y fosforiló los amplicones. . Los amplicones fosforilados se ligan a daptadores de iones y se purifican. Para la preparación de bibliotecas con códigos de barras, reemplazamos los adaptadores con códigos de barras del kit de bibliotecas Ion XpressTM. El ADN ligado se somete a traducción y amplificación de muescas para completar el enlace entre adaptadores y amplicones y para generar material suficiente para la trepación de plantilla corriente abajo. Dos rondas de unión del reactivo Agencourt® AMPure® XP en proporciones de volumen de muestra a 0,6 y 1,2 eliminaron el ADN de entrada y los cebadores no incorporados forman los amplicones. Las moléculas de la biblioteca final tienen un tamaño de 125-300 pb. Luego transferimos las bibliotecas al sistema Ion OneTouchTM para la preparación automática de plantillas. La secuenciación se realiza en el secuenciador Ion PGMTM de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilizamos el software IonTorrent para el análisis de datos automatizado.
• nConjuntos de códigos de variación del número de copias del contador: diseñamos a medida un ensayo de CNV de 21 genes como se describe en un estudio anterior. Los 21 genes incluyeron AURAKA, CCND1, CCNE1, CDK4, CDK6, CDNK1A, CDNK2A, EGFR, ERBB2, ERBB3, FGFR1, FGFR2, IGFR1R, KLF5, KRAS, MDM2, MET, MITF, MYC, PIK3CA y TNIK. Para la detección de CNV, se utilizaron conjuntos de códigos de variación del número de copias nCounter con 200 ng de ADN genómico purificado. El ADN se fragmentó mediante digestión con AluI y se desnaturalizó a 95 °C. El ADN fragmentado se hibridó con el conjunto de códigos de 21 genes en el kit de ensayo nCounter Cancer CN (Nanostring Technologies) durante 18 horas a 65 °C y se procesó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El analizador digital nCounter contó y tabuló las señales de las sondas reporteras. Los datos cuantificados se analizaron utilizando el software de análisis nSolver de NanoString.

• inmunohistoquímica

  : RET, ATM, PD-L1, FGFR2, MLH, EGFR, ALK, ROS, TRKA. MET, HER2, pérdida de PTEN (EGFR,CCNEI en casos seleccionados)

• Exploración del cáncer

  : secuenciación profunda dirigida en Samsung Genome Institute

  : Secuenciación dirigida MiSeq NGS basada en Illumina HiSeq2000/2500

• Detector ASFA™