PCOS의 자궁내막에 대한 프로게스테론의 작용

환자 및 방법

PCOS 여성에 대한 피험자 포함 기준은 다음과 같습니다. a) 18~35세, b) PCOS는 다음 세 가지 특징 중 두 가지를 포함하는 로테르담 기준에 의해 정의되었습니다: a) 희발성 무월경; b) 안드로겐 과다증의 임상적 또는 생화학적 징후; 및 c) 다낭성 난소(6). 이러한 기준은 4개의 PCOS 표현형(A~D)을 생성합니다(1-3). 대조군은 가족 계획 외래 환자 사무실에서 모집되었습니다. 모든 참가자는 규칙적인 생리 주기를 가진 18~35세의 건강한 여성으로, 다모증의 증거가 없고 동반 질환이 없으며 지난 3개월 동안 호르몬 약물을 사용하지 않았습니다.

제외 기준은 다음과 같습니다: a) 지난 3개월 동안 호르몬 치료를 사용한 경우; b) 사이에 채취한 혈액 샘플에서 prolactin, cortisol, dehydroepiandrosterone sulphate(DHEAS), 17-hydroxyprogesterone(17-OHP), androstenedione, 갑상선 자극 호르몬(TSH) 및 유리 T4의 비정상 수치로 입증되는 기타 무배란 원인 주기의 2일과 5일은 순환 피험자, 또는 무월경 피험자는 다른 날; c) 자궁내막증, 고혈압 또는 진성 당뇨병과 같은 부인과 장애 또는 기타 관련 질병; d) 난포 자극 호르몬(FSH) >15 UI/L(주기 2-5일); 또는 e) 인간 융모성 고나도트로핀(β-HCG)의 양성 β-서브유닛.

연구 프로토콜

이 시험은 이전에 브라질 상파울루 대학(FMUSP), 병원 다스 클리니카스, 파쿨다드 드 메디치나의 연구 윤리 위원회(#21253613.6.0000.0068)의 승인을 받았습니다. 환자는 산부인과 외래 환자 사무실에서 평가됩니다. 환자는 a) PCOS 및 b) 대조군의 두 그룹으로 나뉩니다. 모든 피험자는 FMUSP의 Hospital das Clínicas 산부인과의 내분비 부인과 섹션과 인간 생식 센터에서 치료를 받게 됩니다. 사전 동의서에 서명한 후 National Health Board의 결의안 196/96(Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde)에 따라 작성되며, 모든 피험자는 연구에 포함되고 다음과 같이 평가됩니다.

사전 선택: 이 방문에는 다음이 포함됩니다. 병력에 대한 인터뷰; 전반적인 신체 및 부인과 검사; 무게 측정(Filizola 저울, 모델 PL-150, 용량 150kg); 저울에 부착된 금속 stadiometer로 높이 측정; 마지막 늑궁과 장골능 사이의 가장 좁은 부위에서 측정 테이프로 복부 둘레(AC) 측정; 장골능 및 둔부의 둘레에서 측정된 엉덩이 둘레(HC), 체질량 지수(BMI) 및 혈압(BP) 측정; 수정된 Ferriman-Gallwey(mFG) 스코어링 시스템에 따른 9개 영역의 다모증, 8점보다 높은 점수를 가진 환자는 다모증으로 간주됩니다.

월경 주기는 월경 간격이 21~35일이고 혈류가 7일 이하일 때 정상으로 간주됩니다. 주기는 혈류 사이의 기간이 >35일인 경우 무배란으로 특성화되었습니다(1). 무월경은 이전 세 주기에 해당하는 기간 동안 또는 >90일 동안 월경 흐름이 없는 것으로 정의됩니다(1,20).

혈액을 수집하고 질식 골반 초음파를 모든 연구 대상에서 수행할 것입니다.

연구 A: 무월경(주기 >90일) 및 음성 β-HCG가 있는 6명의 PCOS 환자에게 10일 동안 질 경로를 통해 투여되는 미세화 P4(400mg)를 매일 처방합니다. 2개의 자궁내막 생검을 수행할 것이며, 하나는 생리 주기의 5일과 9일 사이에 그리고 다른 하나는 월경 주기의 21일과 24일 사이(P4로 두 번째 치료 주기 아래)(1일은 질 출혈의 첫 번째 날임) 수행될 것입니다. 세 번째 생검은 P4 치료의 4번째 주기인 21일에서 24일 사이에 반복됩니다(그림 2). 연구의 이 부분은 P4가 치료 주기의 수에 관계없이 증식성 자궁내막을 분비성 자궁내막으로 전환시킬 수 있는지 여부를 평가하도록 설계될 것입니다.

연구 B:

PCOS: 17명의 PCOS 피험자는 첫 번째 P4 치료 주기 후 두 번의 자궁내막 생검을 받았습니다. 첫 번째는 주기의 5-9일 사이에, 다른 하나는 주기의 20-22일(즉, P4 치료 중) 사이에 받았습니다.

대조군: 2회의 자궁내막 생검 하에 13명의 배란 조절 여성이 황체 P4 치료의 첫 달 후, 첫 번째는 주기의 5-9일 사이에, 두 번째는 주기의 20-22일 사이에 수행됩니다.

분석 경구 포도당 내성 검사(OGTT)는 탄수화물이 풍부한 식이요법 3일 후 구두로 투여된 75g의 포도당으로 구성되었습니다. 포도당 및 인슐린 측정을 위한 혈액 샘플은 포도당 용액 투여 전과 포도당 용액 복용 후 30, 60, 90 및 120분에 채혈하였다.

혈장 포도당 농도는 포도당 산화효소법으로 측정하였다. 모든 지질 측정은 혈장 샘플에서 직접 수행되었습니다. 총 콜레스테롤과 트리글리세리드는 효소 방법(Roche Laboratories)을 사용하여 평가되었습니다. HDL-C는 같은 방법으로 정량하였고, LDL-C는 Friedwald식으로 추정하였다. 당화혈색소는 고성능액체크로마토그래피(Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer method 2003-2004, Tosoh G7 method 2007-2008, Tosoh Corp)를 이용하여 측정하였다.

호르몬 분석을 위해 혈액 샘플을 원심분리기에서 처리했습니다. 프로게스테론은 Auto DELFIA 키트를 사용하여 면역 형광 분석법(Wallac, Finland)으로 측정했습니다. 안드로스텐디온, PRL, LH 및 FSH, 면역형광분석법; dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), radioimmunoassay (Cisbio International, France 및 DSL, Texas, USA); 및 인슐린 및 17-OHP, DSL 키트를 사용하는 방사면역측정법. 테스토스테론 및 SHBG 수치는 전기화학발광 면역측정법(Modular, Roche)을 사용하여 측정하였다. 자유 테스토스테론 지수는 총 테스토스테론/SHBG*100 공식에 따라 계산되었습니다. 무료 테스토스테론은 Vermeulen의 공식으로 계산되었습니다. 모든 분석은 두 번 수행되었으며 분석 내 및 분석 간 변동 계수는 각각 10% 및 15%를 초과하지 않았습니다.

자궁내막 생검 자궁내막 샘플은 Pipelle de Cornier 카테터(Laboratoire CCD, Paris, France)를 사용하여 얻을 것입니다. 물질의 일부는 조직형태계측 및 면역조직화학적 분석을 위해 파라핀에 내장되었고 나머지는 이후의 분자 분석을 위해 RNA에 보존되었습니다.

조직화학 자궁내막 샘플은 24시간 동안 고정됩니다. 10% 포름알데히드에서, 증가하는 농도의 에틸 알코올에서 탈수되고, 자일렌에서 제거된 다음 파라핀에 포매됩니다. 파라핀 내장 샘플은 피험자당 10개의 3μm 섹션으로 절단됩니다. 이 섹션 중 8개 섹션은 혈관 내피 성장 인자 C(VEGF-C) 및 면역조직화학(아래 참조)에 대해 염색되었으며, 나머지 두 섹션은 제안된 기준을 사용하여 생리 주기 단계를 확인하기 위해 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색됩니다. Noyes 외. (1953) 및 형태 측정법(아래 참조).

섹션은 통상적으로 왁스 제거됩니다. 0.3% H2O2를 사용하여 상온에서 10분간 내인성 과산화효소를 불활성화시킨 후 증류수로 3회 세척한다. 절편을 0.01M 구연산염 완충액(pH 6.0)에 담근 다음 끓는점까지 가열하기 위해 전자레인지에 넣었습니다. 10분 후, 이 과정이 두 번 반복됩니다. 그런 다음 섹션을 실온에서 냉각하고 인산염 완충 식염수(PBS)(pH 7.4)로 두 번 세척했습니다. 5% 소 혈청 알부민(BSA) 차단 용액을 실온에서 20분 동안 첨가하고 과량의 액체를 버렸다. 토끼 항-인간 VEGF-C 다클론 항체(Cell Signaling, Danvers, MA, USA)(VEGF-C: 1:100 희석)를 37°C에서 24시간 동안 배양에 첨가한 다음 절편을 10분 동안 세척했습니다. 5 분. 세 번. biotinylated goat anti-rabbit IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) 작동 용액은 37°C에서 20분 동안 배양하기 위해 1:1000 희석으로 첨가됩니다. 세척 후 SABC를 첨가하여 37℃에서 20분 동안 배양한 후 세척하고 diaminobenzidine(DAB)(DAB 발색 키트, Dako, Dinamarca)을 통해 실온에서 5~30분 동안 발색시킨 다음 증류수로 세척, 단계별 에탄올을 통한 헤마톡실린 재염색 탈수, 크실렌을 통한 투명도, 중성 검을 통한 밀봉, 광학 현미경 검사. 1차 항체는 음성 대조군으로 PBS로 대체되었습니다. 사전 실험에서 만족스럽게 염색된 양성 절편을 양성 대조군으로 사용하였다.

형태학적 및 조직 형태학적 분석 관심 있는 매개변수를 정량화하기 위해 광학 현미경(Axiolab, Carl Zeiss)에 적응된 고해상도 카메라(AxioCam-MCR, Carl Zeiss)를 사용하여 이미지를 캡처하고 40× 대물 렌즈로 조정했습니다. 이미지는 AxioVision Rel 4.2 소프트웨어(Carl Zeiss)를 사용하여 컴퓨터로 전송되었습니다. 선 및 표면 상피 두께, 세포 수 및 새로 형성된 혈관 수를 평가하기 위해 각 환자에 대해 각 자궁 내막 샘플의 10개 이미지를 만들었습니다. VEGF-C 측정을 위해 mm2당 혈관의 수치적 밀도가 설정됩니다.

통계 분석 각 그룹에 필요한 최소 샘플 크기는 파일럿 연구 후 그룹당 10명의 여성을 대상으로 하는 파일럿 연구에서 결정됩니다. 따라서 표본 크기를 계산할 때 그룹 측정 간의 상관 관계가 고려됩니다. 자궁내막 수의 결과는 5%의 제1종 오류와 20%의 제2종 오류(0.8% 검정력을 가진 표본)를 채택하여 그룹 간 >20% 차이를 검출했습니다. 균질성에 상응하여 정량적 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표현됩니다. 데이터 분포에 따라 Student t 테스트 또는 Mann-Whitney U 테스트가 사용됩니다. 유의 수준은 95%(α ≤ 5%)로 설정되었습니다. 또한 ANOVA 또는 Kruskal-Wallis 테스트는 추가 그룹(증식기 동안 PCOS)이 포함된 경우 조직학적 및 면역조직화학적 비교에 사용될 것입니다. 그런 다음 데이터 분포에 따라 Tukey 테스트 또는 Dunn 테스트가 적용됩니다. 가능한 경우 연구 A와 B의 대상을 결합하여 분석했습니다.