Progesteronivaikutus PCOS:n endometriumiin

POTILAAT JA MENETELMÄT

Koehenkilöt PCOS-naisten sisällyttämiskriteerit ovat: a) 18-35-vuotiaat ja b) PCOS määriteltiin Rotterdamin kriteereillä, jotka sisältävät kaksi seuraavista kolmesta ominaisuudesta: a) oligomenorrea; b) hyperandrogenismin kliiniset tai biokemialliset merkit; ja c) monirakkuiset munasarjat (6). Nämä kriteerit tuottavat neljä PCOS-fenotyyppiä (A - D) (1-3). Kontrollit rekrytoitiin perhesuunnittelun avohoitotoimistosta. Kaikki osallistujat ovat terveitä 18–35-vuotiaita naisia, joilla on säännölliset kuukautiskierrot, joilla ei ole merkkejä hirsutismista, ei liitännäissairauksia ja jotka eivät ole käyttäneet hormonilääkkeitä viimeisten 3 kuukauden aikana.

Poissulkemiskriteerit ovat seuraavat: a) minkä tahansa hormonihoidon käyttö viimeisten 3 kuukauden aikana; b) muut anovulaation syyt, joita osoittavat epänormaalit prolaktiinin, kortisolin, dehydroepiandrosteronisulfaatin (DHEAS), 17-hydroksiprogesteronin (17-OHP), androsteenidionin, kilpirauhasta stimuloivan hormonin (TSH) ja vapaan T4:n tasot verinäytteissä, jotka on otettu välillä syklin päivät 2 ja 5 pyöräilijöillä tai minä tahansa muuna päivänä amenorreapotilailla; c) gynekologiset sairaudet tai muut niihin liittyvät sairaudet, kuten endometrioosi, kohonnut verenpaine tai diabetes mellitus; d) follikkelia stimuloiva hormoni (FSH) >15 UI/l (syklipäivät 2-5); tai e) ihmisen koriongonadotropiinin (p-HCG) positiivinen p-alayksikkö.

Tutkimuspöytäkirja

Tämän kokeen on aiemmin hyväksynyt tutkimuksen eettinen komitea (#21253613.6.0000.0068) Faculdade de Medicinassa, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasilia. Potilaat arvioidaan gynekologian poliklinikalla. Potilaat jaetaan kahteen ryhmään: a) PCOS ja b) kontrollit. Kaikista aiheista hoidetaan endokrinologian gynekologian osastolla ja Gynekologian osaston Human Reproductive Centerissä, Hospital das Clínicas, FMUSP. Allekirjoituksen jälkeen tietoinen suostumus kirjoitetaan Kansallisen terveyslautakunnan päätöslauselman 196/96 (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde) mukaisesti, kaikki koehenkilöt sisällytetään tutkimukseen ja niitä arvioidaan seuraavasti:

Esivalinta: Tämä vierailu sisältää seuraavat: haastattelu sairaushistoriaa varten; yleiset fyysiset ja gynekologiset tutkimukset; painonmittaus (Filizola-asteikko, malli PL-150, kantavuus 150 kg); korkeuden mittaus vaakaan kiinnitetyllä metallistadiometrillä; vatsan ympärysmitan (AC) mittaus mittanauhalla kapeimmalta alueelta viimeisen rintakaaren ja suoliluun harjanteen välillä; lonkan ympärysmitta (HC) mitattuna lonkan ympärysmitan ympäriltä suoliluun harjanteen ja pakaroiden yläosassa, painoindeksin (BMI) ja verenpaineen (BP) mittaus; hirsutismi modifioidun Ferriman-Gallweyn (mFG) pisteytysjärjestelmän mukaan yhdeksällä alueella, ja potilaita, joiden pistemäärä on yli 8, katsotaan hirsuteiksi.

Kuukautiskiertoa pidetään normaalina, kun kuukautisten välinen aika oli 21-35 päivää ja verenkierto ei kestänyt enempää kuin 7 päivää. Kierto luonnehdittiin anovulatoriseksi, kun verenkiertojen välinen aika oli >35 päivää (1). Amenorrea määritellään kuukautiskierron puuttumiseksi kolmea edellistä kiertoa vastaavan ajanjakson tai yli 90 päivän ajan (1,20).

Kaikille koehenkilöille otetaan verta ja transvaginaalinen lantion ultraääni tehdään.

Tutkimus A: Kuudelle PCOS-potilaalle, joilla on amenorrea (syklit >90 päivää) ja negatiivinen β-HCG, määrätään päivittäin mikronisoitua P4:ää (400 mg) emättimen kautta 10 päivän ajan. Otetaan kaksi endometriumin biopsiaa, toinen 5. ja 9. päivän välillä ja toinen 21. ja 24. päivän välillä (toisessa hoitojaksossa P4:llä) kuukautiskierrosta (päivä 1 on ensimmäinen emättimen verenvuodon päivä). Kolmas biopsia toistetaan 4. P4-hoidon syklissä syklipäivien 21 ja 24 välillä (kuva 2). Tämä tutkimuksen osa suunnitellaan arvioimaan, voisiko P4 muuttaa proliferatiivisen endometriumiksi, hoitojaksojen lukumäärästä riippumatta.

Tutkimus B:

PCOS: Seitsemäntoista PCOS-potilaalle tehtiin kaksi endometriumin biopsiaa ensimmäisen P4-käsitellyn syklin jälkeen, ensimmäinen syklin päivien 5-9 välillä ja toinen syklin päivien 20-22 välillä (eli P4-hoidon aikana).

Kontrollit: Kolmetoista ovulaation kontrollinaista, joille on otettu kaksi endometriumin biopsiaa, suoritetaan ensimmäisen kuukauden luteaali-P4-hoidon jälkeen, ensimmäinen syklin päivien 5-9 ja toinen kierron päivien 20-22 välillä.

Määritykset Suun kautta otettava glukoositoleranssitesti (OGTT) koostui 75 grammasta glukoosia, joka annettiin suun kautta kolmen päivän hiilihydraattirikkaan ruokavalion jälkeen; Verinäytteet glukoosi- ja insuliinimittauksia varten otettiin ennen glukoosiliuoksen antamista ja 30, 60, 90 ja 120 minuuttia glukoosiliuoksen ottamisen jälkeen.

Plasman glukoosipitoisuus määritettiin glukoosioksidaasimenetelmällä. Kaikki lipidimittaukset otettiin suoraan plasmanäytteistä. Kokonaiskolesteroli ja triglyseridit arvioitiin entsyymimenetelmillä (Roche Laboratories). HDL-kolesteroli kvantifioitiin samalla menetelmällä ja LDL-kolesteroli arvioitiin Friedwaldin kaavalla. Glykoitunut hemoglobiini mitattiin käyttämällä korkean erotuskyvyn nestekromatografiaa (käyttäen Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer -menetelmää vuosina 2003-2004 ja Tosoh G7 -menetelmää vuosina 2007-2008, Tosoh Corp).

Hormonianalyysejä varten verinäytteet käsiteltiin sentrifugissa. Progesteroni mitattiin immunofluorometrisellä määrityksellä (Wallac, Suomi) käyttämällä Auto DELFIA -sarjoja; androsteenidioni, PRL, LH ja FSH immunofluorometrisellä määrityksellä; dehydroepiandrosteronisulfaatti (DHEAS), radioimmunomäärityksellä (Cisbio International, Ranska ja DSL, Texas, USA); ja insuliini ja 17-OHP radioimmunomäärityksellä käyttäen DSL-pakkauksia. Testosteroni- ja SHBG-tasot mitattiin käyttämällä elektrokemiluminesenssi-immunomääritystä (Modular, Roche). Vapaan testosteronin indeksi laskettiin seuraavan kaavan perusteella: kokonaistestosteroni/SHBG*100. Vapaa testosteroni laskettiin Vermeulenin kaavalla. Kaikki analyysit suoritettiin kahdesti, ja määrityksen sisäiset ja määritysten väliset variaatiokertoimet eivät ylittäneet 10 % ja 15 %.

Kohdun limakalvon biopsiat Endometriumnäytteet otetaan käyttämällä Pipelle de Cornier -katetria (Laboratoire CCD, Pariisi, Ranska). Osa materiaalista upotettiin parafiiniin histomorfometrisiä ja immunohistokemiallisia analyyseja varten, ja loput säilytettiin RNA:ssa myöhempiä molekyylianalyysejä varten.

Histokemia Endometriumnäytteet kiinnitetään 24 tunnin ajan. 10 % formaldehydissä, dehydratoitu kasvavilla etyylialkoholipitoisuuksilla, kirkastettu ksyleeniin ja sitten upotettu parafiiniin. Parafiiniin upotetut näytteet leikataan sitten kymmeneen 3 μm:n osaan kohdetta kohden. Kahdeksan näistä osista värjättiin verisuonten endoteelin kasvutekijä C:n (VEGF-C) ja immunohistokemian (katso alla) varalta, ja kaksi jäljellä olevaa leikettä värjätään hematoksyliinilla ja eosiinilla (H&E) kuukautiskierron vaiheen varmistamiseksi ehdotettujen kriteerien mukaisesti. kirjoittaneet Noyes et ai. (1953) ja morfometria (katso alla).

Osat vahat poistetaan tavanomaisesti; 0,3 % H2O2:ta käytetään inaktivoimaan endogeeninen peroksidaasi huoneenlämpötilassa 10 minuutin ajan, minkä jälkeen pestään tislatulla vedellä kolme kertaa. Leikkeet upotettiin 0,01 M sitraattipuskuriin (pH 6,0) ja asetettiin sitten mikroaaltouuniin kuumennettavaksi kiehumispisteeseen. 10 minuutin kuluttua tämä prosessi toistetaan kahdesti; sitten leikkeet jäähdytettiin huoneenlämpötilaan ja pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) (pH 7,4). 5 % naudan seerumialbumiinia (BSA) estävää liuosta lisättiin huoneenlämpötilassa 20 minuutin ajan ja ylimääräinen neste heitettiin pois. Kanin anti-ihmisen VEGF-C polyklonaalisia vasta-aineita (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: laimennettu 1:100) lisättiin inkubaatioon 37 °C:ssa 24 tunnin ajan, ja sitten leikkeet pestiin 5 min. kolmasti. Biotinyloitua vuohen anti-kanin IgG-työliuosta (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) lisätään 1:1000 laimennokseksi inkubaatiota varten 37 °C:ssa 20 minuutin ajan. Pesun jälkeen SABC lisätään inkubaatioon 37 °C:ssa 20 minuutin ajan, minkä jälkeen pesu ja värikehitys diaminobentsidiinin (DAB) avulla (DAB color development kit, Dako, Dinamarca) huoneenlämmössä 5-30 minuutin ajan. pesemällä tislatulla vedellä, hematoksyliinivärjäys uudelleen dehydratoitumalla asteittain etanolilla, läpinäkyvyys ksyleenin avulla, sulkemalla neutraalilla kumilla ja tarkastamalla valomikroskoopilla. Primaarinen vasta-aine korvattiin PBS:llä negatiivisena kontrollina. Positiivisia leikkeitä, jotka värjäytyivät tyydyttävästi esikokeessa, käytettiin positiivisina kontrolleina.

Morfologiset ja histomorfometriset analyysit Kiinnostavien parametrien kvantifioimiseksi kuvat otettiin käyttämällä korkearesoluutioista kameraa (AxioCam-MCR, Carl Zeiss), joka oli sovitettu valomikroskooppiin (Axiolab, Carl Zeiss) ja säädettiin 40-kertaisilla objektiivilinsseillä. Kuvat siirrettiin tietokoneelle AxioVision Rel 4.2 -ohjelmistolla (Carl Zeiss). Rauhasten ja pintaepiteelin paksuuden, solujen lukumäärän ja vasta muodostuneiden verisuonten laskemista varten otettiin kymmenen kuvaa jokaisesta kohdun limakalvonäytteestä kullekin potilaalle. VEGF-C:n määritystä varten määritetään verisuonten numeerinen tiheys per mm2.

Tilastolliset analyysit Kunkin ryhmän tarvittava vähimmäisotoskoko määritetään pilottitutkimuksen perusteella, jossa on 10 naista ryhmää kohden pilottitutkimuksen jälkeen. Näin ollen otoskokoa laskettaessa otetaan huomioon ryhmämittausten välinen korrelaatio. Kohdun limakalvon rauhasten lukumäärän tuloksiin otettiin käyttöön tyypin I virhe 5 % ja tyypin II virhe 20 % (näyte 0,8 % teholla) >20 % eron havaitsemiseksi ryhmien välillä. Homogeenisuuden mukaisesti kvantitatiiviset tiedot ilmaistaan ​​keskiarvona ± standardipoikkeama. Tiedonjakelun mukaisesti käytetään Studentin t-testiä tai Mann-Whitneyn U-testiä. Merkitsevyystasoksi asetettiin 95 % (α ≤ 5 %). Lisäksi ANOVAa tai Kruskal-Wallis-testiä käytetään histologisiin ja immunohistokemiallisiin vertailuihin, kun lisäryhmä (PCOS proliferatiivisen vaiheen aikana) on otettu mukaan. Sitten datan jakautumisen mukaisesti käytetään joko Tukey-testiä tai Dunn-testiä. Mikäli mahdollista, tutkimuksen A ja B kohteet yhdistettiin analysointia varten.