Působení progesteronu na endometrium PCOS

PACIENTI A METODY

Subjekty Kritéria pro zařazení žen s PCOS budou: a) věk 18 až 35 let ab) PCOS bylo definováno Rotterdamským kritériem, které zahrnuje dva z následujících tří znaků: a) oligoamenorea; b) klinické nebo biochemické příznaky hyperandrogenismu; a c) polycystické vaječníky (6). Tato kritéria poskytují čtyři fenotypy PCOS (A až D) (1-3). Kontroly byly rekrutovány z ambulance pro plánování rodičovství. Všichni účastníci budou zdravé ženy ve věku 18 až 35 let s pravidelnými menstruačními cykly, bez známek hirsutismu, bez komorbidit a neužívající hormonální léky v předchozích 3 měsících.

Kritéria vyloučení jsou následující: a) užívání jakékoli hormonální léčby v předchozích 3 měsících; b) jiné příčiny anovulace, jak dokládají abnormální hladiny prolaktinu, kortizolu, dehydroepiandrosteron sulfátu (DHEAS), 17-hydroxyprogesteronu (17-OHP), androstendionu, hormonu stimulujícího štítnou žlázu (TSH) a volného T4 ve vzorcích krve získaných mezi 2. a 5. den cyklu u cyklujících subjektů nebo v kterýkoli jiný den u amenoreických subjektů; c) gynekologické poruchy nebo jiná přidružená onemocnění, jako je endometrióza, hypertenze nebo diabetes mellitus; d) folikuly stimulující hormon (FSH) >15 UI/l (2. až 5. den cyklu); nebo e) pozitivní p-podjednotku lidského choriového gonadotropinu (p-HCG).

Protokol studie

Tato studie byla dříve schválena Etickou komisí pro výzkum (#21253613.6.0000.0068) na Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brazílie. Pacientky budou vyšetřeny na Gynekologické ambulanci. Pacienti budou rozděleni do dvou skupin: a) PCOS ab) kontroly. O všechny subjekty bude pečovat endokrinologická gynekologická sekce a humánní reprodukční centrum Gynekologického oddělení Nemocnice das Clínicas FMUSP. Po podepsání informovaného souhlasu bude sepsán v souladu s rezolucí 196/96 Národní zdravotní rady (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), všechny subjekty budou zahrnuty do studie a hodnoceny následovně:

Předvýběr: Tato návštěva zahrnuje následující: rozhovor pro anamnézu; celkové fyzikální a gynekologické vyšetření; měření hmotnosti (váha Filizola, model PL-150, s nosností 150 kg); měření výšky kovovým stadiometrem připevněným na stupnici; měření obvodu břicha (AC) pomocí měřicí pásky v nejužší oblasti mezi posledním žeberním obloukem a hřebenem kyčelní kosti; obvod boků (HC) měřený kolem obvodu boků v horní části hřebene kyčelního kloubu a hýždí, měření indexu tělesné hmotnosti (BMI) a krevního tlaku (BP); hirsutismus podle modifikovaného skórovacího systému Ferriman-Gallwey (mFG) s devíti oblastmi, přičemž pacienti se skóre vyšším než 8 jsou považováni za ochlupení.

Menstruační cyklus se považuje za normální, když interval mezi menstruacemi byl 21 až 35 dní a průtok krve netrval déle než 7 dní. Cyklus byl charakterizován jako anovulační, když interval mezi průtoky krve byl > 35 dní (1). Amenorea je definována jako absence menstruace po dobu odpovídající třem předchozím cyklům nebo po dobu > 90 dnů (1,20).

Všem studovaným bude odebrána krev a proveden transvaginální pánevní ultrazvuk.

Studie A: Šest pacientkám s PCOS s amenoreou (cykly > 90 dnů) a negativním β-HCG bude denně předepisován mikronizovaný P4 (400 mg) podávaný vaginální cestou po dobu 10 dnů. Budou provedeny dvě endometriální biopsie, jedna mezi 5. a 9. dnem a druhá mezi 21. a 24. dnem (v rámci druhého léčebného cyklu s P4) menstruačního cyklu (den 1 je prvním dnem vaginálního krvácení). Třetí biopsie bude opakována ve 4. cyklu léčby P4 mezi 21. a 24. dnem cyklu (obr. 2). Tato část studie bude navržena tak, aby vyhodnotila, zda P4 může transformovat proliferativní na sekreční endometrium, bez ohledu na počet léčebných cyklů.

Studie B:

PCOS: Sedmnáct subjektů s PCOS podstoupilo dvě endometriální biopsie po prvním cyklu léčeném P4, první mezi 5. až 9. dnem cyklu a další mezi 20. až 22. dnem (tj. při léčbě P4) cyklu.

Kontroly: Třináct ovulačních kontrolních žen pod dvěma biopsiemi endometria bude provedeno po prvním měsíci léčby luteální P4, první mezi 5.-9. dnem a druhý mezi 20.-22. dnem cyklu.

Testy Orální glukózový toleranční test (OGTT) sestával ze 75 gramů glukózy podaných orálně po třech dnech diety bohaté na sacharidy; vzorky krve pro měření glukózy a inzulínu byly odebrány před podáním roztoku glukózy a 30, 60, 90 a 120 minut po podání roztoku glukózy.

Plazmatická koncentrace glukózy byla stanovena glukózooxidázovou metodou. Všechna měření lipidů byla provedena přímo ve vzorcích plazmy. Celkový cholesterol a triglyceridy byly hodnoceny pomocí enzymatických metod (Roche Laboratories). HDL-C byl kvantifikován stejnou metodou a LDL-C byl odhadnut pomocí Friedwaldova vzorce. Glykovaný hemoglobin byl měřen pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (s použitím metody Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer v letech 2003-2004 a metodou Tosoh G7 v letech 2007-2008, Tosoh Corp).

Pro analýzy hormonů byly vzorky krve zpracovány v centrifuze. Progesteron byl měřen imunofluorometrickým testem (Wallac, Finsko) za použití souprav Auto DELFIA; androstendion, PRL, LH a FSH imunofluorometrickým testem; dehydroepiandrosteron sulfát (DHEAS), radioimunoanalýzou (Cisbio International, Francie a DSL, Texas, USA); a inzulín a 17-OHP, radioimunoanalýzou za použití souprav DSL. Hladiny testosteronu a SHBG byly měřeny pomocí elektrochemiluminiscenčního imunotestu (Modular, Roche). Index volného testosteronu byl vypočten na základě následujícího vzorce: celkový testosteron/SHBG*100. Volný testosteron byl vypočten podle Vermeulenova vzorce. Všechny analýzy byly provedeny dvakrát a variační koeficienty v rámci testu a mezi testy nepřesáhly 10 % a 15 %.

Endometriální biopsie Endometriální vzorky budou získány pomocí katetru Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paříž, Francie). Část materiálu byla zalita do parafínu pro histomorfometrické a imunohistochemické analýzy a zbytek byl uchován v RNA pro pozdější molekulární analýzy.

Histochemie Vzorky endometria budou fixovány po dobu 24 hodin. v 10% formaldehydu, dehydratovaný ve zvyšujících se koncentracích ethylalkoholu, vyčištěný v xylenu a poté zalitý v parafínu. Vzorky zalité v parafínu se poté nařežou na deset 3μm řezů na subjekt. Osm z těchto řezů bylo obarveno pro vaskulární endoteliální růstový faktor C (VEGF-C) a pro imunohistochemii (viz níže) a dva zbývající řezy budou obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E), aby se potvrdila fáze menstruačního cyklu pomocí navržených kritérií od Noyese a kol. (1953) a morfometrie (viz níže).

Řezy budou odvoskovány konvenčně; 0,3% H2O2 se použije k inaktivaci endogenní peroxidázy při pokojové teplotě po dobu 10 minut, poté se třikrát promyje destilovanou vodou. Řezy byly ponořeny do 0,01 M citrátového pufru (pH 6,0) a poté umístěny do mikrovlnné trouby k zahřátí až k bodu varu. Po 10 minutách se tento proces opakuje dvakrát; poté byly řezy ochlazeny na teplotu místnosti a dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) (pH 7,4). 5% bovinní sérový albumin (BSA) blokující roztok byl přidán při teplotě místnosti po dobu 20 minut a přebytek kapaliny byl odstraněn. Králičí anti-lidské VEGF-C polyklonální protilátky (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: zředěné v poměru 1:100) byly přidány k inkubaci při 37 °C po dobu 24 hodin a řezy byly poté promyty po dobu 24 hodin. 5 minut. třikrát. Bude přidán biotinylovaný kozí anti-králičí IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) pracovní roztok v ředění 1:1000 pro inkubaci při 37 °C po dobu 20 minut. Po promytí se do inkubace při 37 °C po dobu 20 minut přidá SABC, následuje promytí a vyvolání barvy pomocí diaminobenzidinu (DAB) (DAB color development kit, Dako, Dinamarca) při pokojové teplotě po dobu 5 až 30 minut. promytím destilovanou vodou, hematoxylinem, dehydratací pomocí odstupňovaného ethanolu, průhledností pomocí xylenu, uzavřením pomocí neutrální gumy a kontrolou pod světelným mikroskopem. Primární protilátka byla nahrazena PBS jako negativní kontrola. Pozitivní řezy, které se v předexperimentu uspokojivě obarvily, byly použity jako pozitivní kontroly.

Morfologické a histomorfometrické analýzy Pro kvantifikaci sledovaných parametrů byly snímky pořízeny pomocí kamery s vysokým rozlišením (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) přizpůsobené světelnému mikroskopu (Axiolab, Carl Zeiss) a upraveny čočkami objektivu 40×. Obrázky byly přeneseny do počítače se softwarem AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Pro hodnocení tloušťky žlázového a povrchového epitelu, počtu buněk a počítání nově vytvořených krevních cév bylo provedeno deset snímků každého vzorku endometria pro každou pacientku. Pro stanovení VEGF-C bude stanovena numerická hustota krevních cév na mm2.

Statistické analýzy Minimální velikost vzorku potřebná pro každou skupinu bude určena z pilotní studie s 10 ženami na skupinu po pilotní studii. Při výpočtu velikosti vzorku bude tedy uvažována korelace mezi skupinovými měřeními. Pro výsledky počtu endometriálních žláz byla přijata chyba typu I 5 % a chyba typu II 20 % (vzorek s 0,8 % mocninou) pro detekci >20 % rozdílu mezi skupinami. Přiměřeně homogenitě budou kvantitativní údaje vyjádřeny jako průměr ± standardní odchylka. V souladu s distribucí dat bude použit Studentův t test nebo Mann-Whitney U test. Hladina významnosti byla stanovena na 95 % (α ≤ 5 %). Kromě toho bude pro histologická a imunohistochemická srovnání použita ANOVA nebo Kruskal-Wallisův test, pokud byla zahrnuta další skupina (PCOS během proliferativní fáze). Poté bude v souladu s distribucí dat aplikován buď Tukeyho test, nebo Dunnův test. Pokud to bylo možné, byly subjekty studie A a B kombinovány pro analýzu.