Action de la progestérone sur l'endomètre du SOPK

PATIENTS ET MÉTHODES

Sujets Les critères d'inclusion pour les femmes atteintes du SOPK seront : a) âgées de 18 à 35 ans, et b) le SOPK a été défini par les critères de Rotterdam, qui comprennent deux des trois caractéristiques suivantes : a) oligo-aménorrhée ; b) des signes cliniques ou biochimiques d'hyperandrogénie ; et c) ovaires polykystiques (6). Ces critères donnent quatre phénotypes du SOPK (A à D) (1-3). Les témoins ont été recrutés dans le bureau ambulatoire de planification familiale. Toutes les participantes seront des femmes en bonne santé âgées de 18 à 35 ans avec des cycles menstruels réguliers, aucun signe d'hirsutisme, aucune comorbidité et n'ayant pas utilisé de médicaments hormonaux au cours des 3 mois précédents.

Les critères d'exclusion sont les suivants : a) utilisation de tout traitement hormonal au cours des 3 mois précédents ; b) d'autres causes d'anovulation mises en évidence par des taux anormaux de prolactine, de cortisol, de sulfate de déhydroépiandrostérone (DHEAS), de 17-hydroxyprogestérone (17-OHP), d'androstènedione, d'hormone stimulant la thyroïde (TSH) et de T4 libre, dans des échantillons de sang obtenus entre les jours 2 et 5 du cycle chez les sujets cyclistes ou tout autre jour chez les sujets aménorrhéiques ; c) des troubles gynécologiques ou d'autres maladies associées, telles que l'endométriose, l'hypertension ou le diabète sucré ; d) hormone folliculo-stimulante (FSH) > 15 UI/L (jours 2 à 5 du cycle) ; ou e) une sous-unité β positive de la gonadotrophine chorionique humaine (β-HCG).

Protocole d'étude

Cet essai a été précédemment approuvé par le comité d'éthique de la recherche (#21253613.6.0000.0068) de la Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brésil. Les patients seront évalués au bureau ambulatoire de gynécologie. Les patients seront divisés en deux groupes : a) SOPK et b) témoins. Tous les sujets seront pris en charge à la section d'endocrinologie gynécologie et au centre de reproduction humaine de la division de gynécologie, Hospital das Clínicas, FMUSP. Après signature, le consentement éclairé sera écrit conformément à la résolution 196/96 du Conseil national de la santé (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), tous les sujets seront inclus dans l'étude et évalués comme suit :

Présélection : Cette visite comprend les éléments suivants : entretien pour les antécédents médicaux ; examens physiques et gynécologiques généraux ; mesure du poids (balance Filizola, modèle PL-150, d'une capacité de 150 kg); mesure de la hauteur avec un stadiomètre métallique fixé à l'échelle; mesure de la circonférence abdominale (AC) avec un ruban à mesurer dans la région la plus étroite entre le dernier arc costal et la crête iliaque ; circonférence de la hanche (HC) mesurée autour de la circonférence des hanches au sommet de la crête iliaque et des fesses, mesure de l'indice de masse corporelle (IMC) et de la pression artérielle (TA); hirsutisme selon le système de notation modifié de Ferriman-Gallwey (mFG) à neuf zones, les patients ayant un score supérieur à 8 étant considérés comme hirsutes.

Le cycle menstruel est considéré comme normal lorsque l'intervalle entre les règles était de 21 à 35 jours et que le flux sanguin ne durait pas plus de 7 jours. Le cycle était caractérisé comme anovulatoire lorsque l'intervalle entre les flux sanguins était > 35 jours (1). L'aménorrhée est définie comme l'absence de flux menstruel pendant une période correspondant aux trois cycles précédents ou pendant > 90 jours (1,20).

Des échantillons de sang seront prélevés et une échographie pelvienne transvaginale sera effectuée sur tous les sujets de l'étude.

Etude A : Six patientes atteintes du SOPK en aménorrhée (cycles > 90 jours) et β-HCG négatif se verront prescrire quotidiennement du P4 micronisé (400 mg) administré par voie vaginale pendant 10 jours. Deux biopsies endométriales seront réalisées, l'une entre le 5ème et le 9ème jour et l'autre entre le 21ème et le 24ème jour (sous le deuxième cycle de traitement avec P4) du cycle menstruel (le jour 1 étant le premier jour des saignements vaginaux). Une troisième biopsie sera répétée au 4ème cycle de traitement P4, entre les jours 21 et 24 du cycle (Fig. 2). Cette partie de l'étude sera conçue pour évaluer si P4 pourrait transformer l'endomètre prolifératif en endomètre sécrétoire, quel que soit le nombre de cycles de traitement.

Étude B :

SOPK : Dix-sept sujets SOPK ont subi deux biopsies endométriales après le premier cycle traité au P4, la première entre les jours 5 à 9 du cycle et l'autre entre les jours 20 à 22 (c'est-à-dire sous traitement P4) du cycle.

Contrôles : Treize femmes contrôlent l'ovulation sous deux biopsies de l'endomètre, seront effectuées après le premier mois de traitement P4 lutéal, la première entre les jours 5-9 et la seconde entre les jours 20-22 du cycle.

Dosages Le test de tolérance au glucose par voie orale (OGTT) consistait en 75 grammes de glucose administrés par voie orale après trois jours de régime riche en glucides ; des échantillons de sang pour les mesures de glucose et d'insuline ont été prélevés avant l'administration de la solution de glucose et 30, 60, 90 et 120 minutes après la prise de la solution de glucose.

La concentration plasmatique de glucose a été déterminée par la méthode de la glucose oxydase. Toutes les mesures de lipides ont été prises directement dans les échantillons de plasma. Le cholestérol total et les triglycérides ont été évalués par des méthodes enzymatiques (Roche Laboratories). Le HDL-C a été quantifié par la même méthode et le LDL-C a été estimé avec la formule de Friedwald. L'hémoglobine glyquée a été dosée par chromatographie liquide haute performance (avec utilisation de la méthode Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer en 2003-2004 et de la méthode Tosoh G7 en 2007-2008, Tosoh Corp).

Pour les analyses hormonales, les échantillons de sang ont été traités dans une centrifugeuse. La progestérone a été mesurée par le dosage immunofluorométrique (Wallac, Finlande) à l'aide des kits Auto DELFIA ; androstènedione, PRL, LH et FSH, par le dosage immunofluorométrique ; le sulfate de déhydroépiandrostérone (DHEAS), par radioimmunodosage (Cisbio International, France et DSL, Texas, USA) ; et l'insuline et le 17-OHP, par dosage radio-immunologique à l'aide de kits DSL. Les taux de testostérone et de SHBG ont été mesurés à l'aide de l'immunodosage électrochimiluminescent (Modular, Roche). L'indice de testostérone libre a été calculé selon la formule suivante : testostérone totale/SHBG*100. La testostérone libre a été calculée par la formule de Vermeulen. Toutes les analyses ont été effectuées deux fois et les coefficients de variation intra-essai et inter-essai n'ont pas dépassé 10 % et 15 %, respectivement.

Biopsies de l'endomètre Des échantillons d'endomètre seront obtenus à l'aide du cathéter Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Paris, France). Une partie du matériel a été incorporée dans de la paraffine pour des analyses histomorphométriques et immunohistochimiques, et le reste a été conservé dans de l'ARN pour des analyses moléculaires ultérieures.

Histochimie Les échantillons endométriaux seront fixés pendant 24 heures. dans du formaldéhyde à 10 %, déshydraté dans des concentrations croissantes d'alcool éthylique, clarifié dans du xylène, puis inclus dans de la paraffine. Les échantillons inclus en paraffine seront ensuite découpés en dix sections de 3 μm par sujet. Huit de ces sections ont été colorées pour le facteur de croissance endothélial vasculaire C (VEGF-C) et pour l'immunohistochimie (voir ci-dessous), et les deux sections restantes seront colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) pour confirmer la phase du cycle menstruel en utilisant les critères suggérés par Noyes et al. (1953) et morphométrie (voir ci-dessous).

Les coupes seront déparaffinées de façon conventionnelle ; 0,3% H2O2 sera utilisé pour inactiver la peroxydase endogène à température ambiante pendant 10 min, suivi d'un lavage à l'eau distillée trois fois. Les coupes ont été immergées dans un tampon citrate 0,01 M (pH 6,0) puis placées dans un four à micro-ondes pour être chauffées jusqu'au point d'ébullition. Après 10 min, ce processus sera répété deux fois ; ensuite, les coupes ont été refroidies à température ambiante et lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (pH 7,4). Une solution de blocage d'albumine de sérum bovin (BSA) à 5 % a été ajoutée à température ambiante pendant 20 minutes et le liquide en excès a été jeté. Des anticorps polyclonaux de lapin anti-VEGF-C humain (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C : dilué à 1:100) ont été ajoutés à l'incubation à 37°C pendant 24 h, et les coupes ont ensuite été lavées pendant 5 min. trois fois. Une solution de travail d'IgG anti-lapin de chèvre biotinylée (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) sera ajoutée à une dilution de 1:1000 pour une incubation à 37°C pendant 20 min. Après lavage, SABC sera ajouté à l'incubation à 37°C pendant 20 min, suivi d'un lavage et d'un développement de couleur via diaminobenzidine (DAB) (kit de développement de couleur DAB, Dako, Dinamarca) à température ambiante pendant 5 à 30 min., suivi par lavage à l'eau distillée, recoloration à l'hématoxyline, déshydratation à l'éthanol gradué, transparence au xylène, scellement à la gomme neutre et inspection au microscope optique. L'anticorps primaire a été remplacé par du PBS comme contrôle négatif. Les sections positives qui se sont colorées de manière satisfaisante dans la pré-expérience ont été utilisées comme témoins positifs.

Analyses morphologiques et histomorphométriques Pour quantifier les paramètres d'intérêt, des images ont été capturées à l'aide d'une caméra haute résolution (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) adaptée à un microscope optique (Axiolab, Carl Zeiss) et ajustée avec des objectifs 40×. Les images ont été transmises à un ordinateur avec le logiciel AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Pour l'évaluation de l'épaisseur épithéliale glandulaire et superficielle, du nombre de cellules et du comptage des vaisseaux sanguins nouvellement formés, dix images de chaque échantillon d'endomètre ont été réalisées pour chaque patiente. Pour la détermination du VEGF-C, la densité numérique des vaisseaux sanguins par mm2 sera établie.

Analyses statistiques La taille minimale de l'échantillon nécessaire pour chaque groupe sera déterminée à partir d'une étude pilote avec 10 femmes par groupe après l'étude pilote. Ainsi, lors du calcul de la taille de l'échantillon, la corrélation entre les mesures du groupe sera prise en compte. Pour les résultats du nombre de glandes endométriales, une erreur de type I de 5 % et une erreur de type II de 20 % (échantillon avec une puissance de 0,8 %) ont été adoptées pour la détection d'une différence > 20 % entre les groupes. En fonction de l'homogénéité, les données quantitatives seront exprimées en moyenne ± écart type. Conformément à la distribution des données, le test t de Student ou le test U de Mann-Whitney seront utilisés. Le seuil de signification a été fixé à 95 % (α ≤ 5 %). De plus, l'ANOVA ou le test de Kruskal-Wallis seront utilisés pour les comparaisons histologiques et immunohistochimiques, lorsque le groupe supplémentaire (SOPK pendant la phase proliférative) a été inclus. Ensuite, conformément à la distribution des données, soit le test de Tukey, soit le test de Dunn sera appliqué. Dans la mesure du possible, les sujets des études A et B ont été combinés pour l'analyse.