Azione del progesterone sull'endometrio della PCOS

PAZIENTI E METODI

Soggetti I criteri di inclusione per le donne con PCOS saranno: a) età compresa tra 18 e 35 anni, eb) la PCOS è stata definita dai criteri di Rotterdam, che include due delle seguenti tre caratteristiche: a) oligo-amenorrea; b) segni clinici o biochimici di iperandrogenismo; e c) ovaie policistiche (6). Questi criteri producono quattro fenotipi PCOS (da A a D) (1-3). I controlli sono stati reclutati dall'ambulatorio di pianificazione familiare. Tutti i partecipanti saranno donne sane di età compresa tra 18 e 35 anni con cicli mestruali regolari, nessuna evidenza di irsutismo, nessuna comorbidità e che non hanno utilizzato farmaci ormonali nei 3 mesi precedenti.

I criteri di esclusione sono i seguenti: a) uso di qualsiasi trattamento ormonale nei 3 mesi precedenti; b) altre cause di anovulazione come evidenziato da livelli anormali di prolattina, cortisolo, deidroepiandrosterone solfato (DHEAS), 17-idrossiprogesterone (17-OHP), androstenedione, ormone stimolante la tiroide (TSH) e T4 libero, in campioni di sangue ottenuti tra i giorni 2 e 5 del ciclo nei soggetti in bicicletta o qualsiasi altro giorno nei soggetti amenorroici; c) disturbi ginecologici o altre malattie associate, quali endometriosi, ipertensione o diabete mellito; d) ormone follicolo-stimolante (FSH) >15 UI/L (giorni di ciclo 2-5); o e) una subunità β positiva della gonadotropina corionica umana (β-HCG).

Protocollo di studio

Questo studio è stato precedentemente approvato dal Comitato etico della ricerca (#21253613.6.0000.0068) della Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), San Paolo, Brasile. I pazienti saranno valutati presso l'ambulatorio di Ginecologia. I pazienti saranno divisi in due gruppi: a) PCOS eb) controlli. Tutti i soggetti saranno assistiti presso la Sezione di Ginecologia di Endocrinologia e il Centro di Riproduzione Umana della Divisione di Ginecologia, Hospital das Clínicas, FMUSP. Dopo aver firmato il consenso informato sarà scritto in conformità con la Risoluzione 196/96 del National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), tutti i soggetti saranno inclusi nello studio e valutati come segue:

Preselezione: Questa visita include quanto segue: colloquio per anamnesi; esami fisici e ginecologici complessivi; misurazione del peso (bilancia Filizola, modello PL-150, con una portata di 150 kg); misurazione dell'altezza con uno stadiometro metallico attaccato alla bilancia; misurazione della circonferenza addominale (AC) con metro a nastro nella regione più stretta tra l'ultimo arco costale e la cresta iliaca; circonferenza dell'anca (HC) misurata attorno alla circonferenza dei fianchi nella parte superiore della cresta iliaca e dei glutei, misurazione dell'indice di massa corporea (BMI) e della pressione sanguigna (BP); irsutismo secondo il sistema di punteggio Ferriman-Gallwey modificato (mFG) con nove aree, con pazienti con un punteggio superiore a 8 punteggio considerato irsuto.

Il ciclo mestruale è considerato normale quando l'intervallo tra i periodi era compreso tra 21 e 35 giorni e il flusso sanguigno non è durato più di 7 giorni. Il ciclo è stato caratterizzato come anovulatorio quando l'intervallo tra i flussi di sangue era > 35 giorni (1). L'amenorrea è definita come l'assenza di flusso mestruale per un periodo corrispondente ai tre cicli precedenti o per >90 giorni (1,20).

Verrà raccolto il sangue e verrà eseguita un'ecografia pelvica transvaginale su tutti i soggetti dello studio.

Studio A: a sei pazienti con PCOS con amenorrea (cicli >90 giorni) e β-HCG negativo verrà prescritto giornalmente P4 micronizzato (400 mg) somministrato per via vaginale per 10 giorni. Verranno eseguite due biopsie endometriali, una tra il 5° e il 9° giorno e l'altra tra il 21° e il 24° giorno (sotto il secondo ciclo di trattamento con P4) del ciclo mestruale (il giorno 1 è il primo giorno di sanguinamento vaginale). Una terza biopsia verrà ripetuta al 4° ciclo di trattamento con P4, tra i giorni 21 e 24 del ciclo (Fig. 2). Questa parte dello studio sarà progettata per valutare se P4 potrebbe trasformare l'endometrio proliferativo in secretorio, indipendentemente dal numero di cicli di trattamento.

Studio B:

PCOS: diciassette soggetti con PCOS sono stati sottoposti a due biopsie endometriali dopo il primo ciclo trattato con P4, la prima tra i giorni 5-9 del ciclo e l'altra tra i giorni 20-22 (cioè sotto trattamento con P4) del ciclo.

Controlli: Tredici donne di controllo ovulatorie sottoposte a due biopsie endometriali, verranno eseguite dopo il primo mese di trattamento della P4 luteale, la prima tra i giorni 5-9 e la seconda tra i giorni 20-22 del ciclo.

Dosaggi Il test di tolleranza al glucosio orale (OGTT) consisteva in 75 grammi di glucosio somministrati per via orale dopo tre giorni di dieta ricca di carboidrati; i campioni di sangue per le misurazioni del glucosio e dell'insulina sono stati prelevati prima della somministrazione della soluzione di glucosio e 30, 60, 90 e 120 minuti dopo l'assunzione della soluzione di glucosio.

La concentrazione plasmatica di glucosio è stata determinata con il metodo della glucosio ossidasi. Tutte le misurazioni dei lipidi sono state effettuate direttamente nei campioni di plasma. Il colesterolo totale ei trigliceridi sono stati valutati utilizzando metodi enzimatici (Roche Laboratories). L'HDL-C è stato quantificato con lo stesso metodo e l'LDL-C è stato stimato con la formula di Friedwald. L'emoglobina glicata è stata misurata utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione (con l'uso del metodo Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer nel 2003-2004 e il metodo Tosoh G7 nel 2007-2008, Tosoh Corp).

Per le analisi ormonali, i campioni di sangue sono stati processati in una centrifuga. Il progesterone è stato misurato mediante il test immunofluorimetrico (Wallac, Finlandia) utilizzando i kit Auto DELFIA; androstenedione, PRL, LH e FSH, mediante saggio immunofluorimetrico; deidroepiandrosterone solfato (DHEAS), mediante dosaggio radioimmunologico (Cisbio International, Francia e DSL, Texas, USA); e insulina e 17-OHP, mediante dosaggio radioimmunologico utilizzando kit DSL. I livelli di testosterone e SHBG sono stati misurati utilizzando il saggio immunologico elettrochemiluminescente (Modular, Roche). L'indice di testosterone libero è stato calcolato sulla base della seguente formula: testosterone totale/SHBG*100. Il testosterone libero è stato calcolato con la formula di Vermeulen. Tutte le analisi sono state eseguite due volte e i coefficienti di variazione intra-saggio e intersaggio non hanno superato rispettivamente il 10% e il 15%.

Biopsie endometriali I campioni endometriali saranno prelevati utilizzando il catetere Pipelle de Cornier (Laboratoire CCD, Parigi, Francia). Parte del materiale è stato incorporato in paraffina per analisi istomorfometriche e immunoistochimiche e il resto è stato conservato in RNA per successive analisi molecolari.

Istochimica I campioni endometriali saranno fissati per 24 ore. in formaldeide al 10%, disidratato in concentrazioni crescenti di alcool etilico, chiarificato in xilene e quindi incorporato in paraffina. I campioni inclusi in paraffina verranno quindi tagliati in dieci sezioni da 3 μm per soggetto. Otto di queste sezioni sono state colorate per Vascular Endothelial Growth Factor C (VEGF-C) e per immunoistochimica (vedi sotto), e le due sezioni rimanenti saranno colorate con ematossilina ed eosina (H&E) per confermare la fase del ciclo mestruale utilizzando i criteri suggeriti di Noyes et al. (1953) e morfometria (vedi sotto).

Le sezioni saranno decerate convenzionalmente; Lo 0.3% di H2O2 verrà utilizzato per inattivare la perossidasi endogena a temperatura ambiente per 10 min, seguito da tre lavaggi con acqua distillata. Le sezioni sono state immerse in tampone citrato 0,01 M (pH 6,0) e quindi poste in un forno a microonde per il riscaldamento fino al punto di ebollizione. Dopo 10 minuti, questo processo verrà ripetuto due volte; quindi, le sezioni sono state raffreddate a temperatura ambiente e lavate due volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) (pH 7,4). Una soluzione bloccante di albumina di siero bovino (BSA) al 5% è stata aggiunta a temperatura ambiente per 20 minuti e il liquido in eccesso è stato scartato. Anticorpi policlonali di coniglio anti-VEGF-C umano (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: diluito a 1:100) sono stati aggiunti all'incubazione a 37°C per 24 ore e le sezioni sono state quindi lavate per 5 minuti. tre volte. Una soluzione di lavoro di IgG anti-coniglio di capra biotinilata (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) sarà aggiunta alla diluizione 1:1000 per l'incubazione a 37°C per 20 min. Dopo il lavaggio, SABC verrà aggiunto all'incubazione a 37°C per 20 min, seguito dal lavaggio e dallo sviluppo del colore tramite diaminobenzidina (DAB) (kit di sviluppo del colore DAB, Dako, Dinamarca) a temperatura ambiente per 5-30 min., seguito mediante lavaggio con acqua distillata, ematossilina che ricolora la disidratazione tramite etanolo graduato, trasparenza tramite xilene, sigillatura tramite gomma neutra e ispezione al microscopio ottico. L'anticorpo primario è stato sostituito con PBS come controllo negativo. Le sezioni positive che si sono colorate in modo soddisfacente nel pre-esperimento sono state utilizzate come controlli positivi.

Analisi morfologiche e istomorfometriche Per quantificare i parametri di interesse, le immagini sono state acquisite utilizzando una fotocamera ad alta risoluzione (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) adattata a un microscopio ottico (Axiolab, Carl Zeiss) e regolata con obiettivi 40×. Le immagini sono state trasmesse ad un computer con software AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss). Per la valutazione dello spessore epiteliale ghiandolare e superficiale, il conteggio delle cellule e il conteggio dei vasi sanguigni di nuova formazione, sono state effettuate dieci immagini di ciascun campione endometriale per ciascun paziente. Per la determinazione del VEGF-C, sarà stabilita la densità numerica dei vasi sanguigni per mm2.

Analisi statistiche La dimensione minima del campione necessaria per ciascun gruppo sarà determinata da uno studio pilota con 10 donne per gruppo dopo lo studio pilota. Pertanto, nel calcolo della dimensione del campione, verrà considerata la correlazione tra le misurazioni del gruppo. Per i risultati del numero di ghiandole endometriali, sono stati adottati un errore di tipo I del 5% e un errore di tipo II del 20% (campione con potenza dello 0,8%) per il rilevamento di una differenza> 20% tra i gruppi. Commisurati all'omogeneità, i dati quantitativi saranno espressi come media ± deviazione standard. In conformità con la distribuzione dei dati, verrà utilizzato il test t di Student o il test U di Mann-Whitney. Il livello di significatività è stato fissato al 95% (α ≤ 5%). Inoltre, ANOVA o il test di Kruskal-Wallis saranno utilizzati per confronti istologici e immunoistochimici, quando è stato incluso il gruppo aggiuntivo (PCOS durante la fase proliferativa). Quindi, in linea con la distribuzione dei dati, verrà applicato il test di Tukey o il test di Dunn. Quando possibile, i soggetti dello Studio A e B sono stati combinati per l'analisi.