Progesteron-Wirkung auf das Endometrium von PCOS

PATIENTEN UND METHODEN

Themen Einschlusskriterien für PCOS-Frauen sind: a) Alter 18 bis 35 Jahre, und b) PCOS wurde durch die Rotterdam-Kriterien definiert, die zwei der folgenden drei Merkmale umfassen: a) Oligo-Amenorrhoe; b) klinische oder biochemische Anzeichen von Hyperandrogenismus; und c) polyzystische Eierstöcke (6). Diese Kriterien ergeben vier PCOS-Phänotypen (A bis D) (1-3). Die Kontrollpersonen wurden aus der Ambulanz für Familienplanung rekrutiert. Alle Teilnehmerinnen sind gesunde Frauen im Alter von 18 bis 35 Jahren mit regelmäßigen Menstruationszyklen, ohne Anzeichen von Hirsutismus, ohne Komorbiditäten und ohne Einnahme von Hormonmedikamenten in den letzten 3 Monaten.

Ausschlusskriterien sind wie folgt: a) Anwendung jeglicher Hormonbehandlung in den letzten 3 Monaten; b) andere Ursachen der Anovulation, nachgewiesen durch anormale Werte von Prolaktin, Cortisol, Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), 17-Hydroxyprogesteron (17-OHP), Androstendion, Thyreoidea-stimulierendem Hormon (TSH) und freiem T4, in zwischenzeitlich entnommenen Blutproben an den Tagen 2 und 5 des Zyklus bei Personen mit Radsport oder an jedem anderen Tag bei Personen mit Amenorrhoe; c) gynäkologische Störungen oder andere damit verbundene Erkrankungen wie Endometriose, Bluthochdruck oder Diabetes mellitus; d) Follikel-stimulierendes Hormon (FSH) > 15 UI/L (Zyklustage 2-5); oder e) eine positive β-Untereinheit von humanem Choriongonadotropin (β-HCG).

Studienprotokoll

Diese Studie wurde zuvor von der Forschungsethikkommission (#21253613.6.0000.0068) der Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasilien, genehmigt. Die Patientinnen werden in der Ambulanz der Gynäkologie untersucht. Die Patienten werden in zwei Gruppen eingeteilt: a) PCOS und b) Kontrollen. Alle Fächer werden in der Abteilung für Endokrinologie und Gynäkologie und im Zentrum für menschliche Reproduktion der Abteilung für Gynäkologie, Hospital das Clínicas, FMUSP, betreut. Nach der Unterzeichnung der Einverständniserklärung wird gemäß der Resolution 196/96 des National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde) geschrieben, alle Probanden werden in die Studie aufgenommen und wie folgt bewertet:

Vorauswahl: Dieser Besuch beinhaltet Folgendes: Anamnesegespräch; umfassende körperliche und gynäkologische Untersuchungen; Gewichtsmessung (Waage Filizola, Modell PL-150, mit einer Kapazität von 150 kg); Höhenmessung mit einem an der Waage befestigten Metallstadiometer; Messung des Bauchumfangs (AC) mit Maßband an der engsten Stelle zwischen dem letzten Rippenbogen und dem Beckenkamm; Hüftumfang (HC) gemessen um den Umfang der Hüften an der Spitze des Beckenkamms und Gesäßes, Messung des Body-Mass-Index (BMI) und des Blutdrucks (BP); Hirsutismus nach dem modifizierten Ferriman-Gallwey (mFG)-Scoring-System mit neun Arealen, wobei Patienten mit einem Score über 8 als behaart gelten.

Der Menstruationszyklus gilt als normal, wenn das Intervall zwischen den Perioden 21 bis 35 Tage betrug und der Blutfluss nicht länger als 7 Tage anhielt. Der Zyklus wurde als anovulatorisch charakterisiert, wenn die Zeitspanne zwischen den Blutflüssen > 35 Tage betrug (1). Amenorrhoe ist definiert als das Ausbleiben eines Menstruationsflusses für einen Zeitraum, der den drei vorangegangenen Zyklen entspricht, oder für > 90 Tage (1,20).

Bei allen Studienteilnehmern wird Blut abgenommen und ein transvaginaler Ultraschall des Beckens durchgeführt.

Studie A: Sechs PCOS-Patienten mit Amenorrhoe (Zyklen > 90 Tage) und negativem β-HCG wird 10 Tage lang täglich mikronisiertes P4 (400 mg) verschrieben, das vaginal verabreicht wird. Es werden zwei Endometriumbiopsien durchgeführt, eine zwischen dem 5. und 9. Tag und die andere zwischen dem 21. und 24. Tag (unter dem zweiten Behandlungszyklus mit P4) des Menstruationszyklus (Tag 1 ist der erste Tag der vaginalen Blutung). Eine dritte Biopsie wird im 4. Zyklus der P4-Behandlung zwischen Zyklustag 21 und 24 wiederholt (Abb. 2). Dieser Teil der Studie soll beurteilen, ob P4 proliferatives in sekretorisches Endometrium umwandeln könnte, unabhängig von der Anzahl der Behandlungszyklen.

Studie B:

PCOS: Siebzehn PCOS-Subjektinnen wurden nach dem ersten mit P4 behandelten Zyklus zwei Endometriumbiopsien unterzogen, die erste zwischen den Tagen 5–9 des Zyklus und die andere zwischen den Tagen 20–22 (d. h. unter P4-Behandlung) des Zyklus.

Kontrollen: Dreizehn ovulatorische Kontrollfrauen unter zwei Endometriumbiopsien werden nach dem ersten Monat der Luteal-P4-Behandlung durchgeführt, die erste zwischen den Tagen 5–9 und die zweite zwischen den Tagen 20–22 des Zyklus.

Assays Der orale Glukosetoleranztest (OGTT) bestand aus 75 Gramm Glukose, die nach drei Tagen einer kohlenhydratreichen Diät oral verabreicht wurden; Blutproben für Glukose- und Insulinmessungen wurden vor Verabreichung der Glukoselösung und 30, 60, 90 und 120 Minuten nach Einnahme der Glukoselösung entnommen.

Die Plasmaglukosekonzentration wurde durch das Glukoseoxidaseverfahren bestimmt. Alle Lipidmessungen wurden direkt in den Plasmaproben durchgeführt. Gesamtcholesterin und Triglyceride wurden unter Verwendung von Enzymmethoden (Roche Laboratories) bestimmt. Das HDL-C wurde mit der gleichen Methode quantifiziert und LDL-C wurde mit der Friedwald-Formel geschätzt. Das glykierte Hämoglobin wurde unter Verwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen (unter Verwendung des Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzer-Verfahrens in den Jahren 2003–2004 und des Tosoh G7-Verfahrens in den Jahren 2007–2008, Tosoh Corp).

Für Hormonanalysen wurden die Blutproben in einer Zentrifuge aufgearbeitet. Progesteron wurde durch den immunofluorometrischen Assay (Wallac, Finnland) unter Verwendung von Auto DELFIA-Kits gemessen; Androstendion, PRL, LH und FSH, durch den immunfluorometrischen Assay; Dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), durch Radioimmunoassay (Cisbio International, Frankreich und DSL, Texas, USA); und Insulin und 17-OHP, durch Radioimmunoassay unter Verwendung von DSL-Kits. Die Testosteron- und SHBG-Spiegel wurden unter Verwendung des Elektrochemilumineszenz-Immunassays (Modular, Roche) gemessen. Der freie Testosteronindex wurde auf der Grundlage der folgenden Formel berechnet: Gesamttestosteron/SHBG*100. Freies Testosteron wurde nach der Formel von Vermeulen berechnet. Alle Analysen wurden zweimal durchgeführt und die Intra-Assay- und Inter-Assay-Variationskoeffizienten überstiegen 10 % bzw. 15 % nicht.

Endometriumbiopsien Endometriumproben werden mit dem Pipelle de Cornier-Katheter (Laboratoire CCD, Paris, Frankreich) entnommen. Ein Teil des Materials wurde für histomorphometrische und immunhistochemische Analysen in Paraffin eingebettet, der Rest wurde für spätere molekulare Analysen in RNA konserviert.

Histochemie Endometriumproben werden für 24 Stunden fixiert. in 10 % Formaldehyd, dehydriert in zunehmenden Konzentrationen von Ethylalkohol, in Xylol geklärt und dann in Paraffin eingebettet. Die in Paraffin eingebetteten Proben werden dann in zehn 3-μm-Schnitte pro Proband geschnitten. Acht dieser Schnitte wurden auf vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor C (VEGF-C) und auf Immunhistochemie gefärbt (siehe unten), und die beiden verbleibenden Schnitte werden mit Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbt, um die Menstruationszyklusphase anhand der vorgeschlagenen Kriterien zu bestätigen von Noyes et al. (1953) und Morphometrie (siehe unten).

Schnitte werden konventionell entparaffiniert; 0,3 % H2O2 wird zur Inaktivierung der endogenen Peroxidase bei Raumtemperatur für 10 min verwendet, gefolgt von dreimaligem Waschen mit destilliertem Wasser. Die Schnitte wurden in 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) getaucht und dann zum Erhitzen bis zum Siedepunkt in einen Mikrowellenofen gegeben. Nach 10 min wird dieser Vorgang zweimal wiederholt; dann wurden die Schnitte auf Raumtemperatur gekühlt und zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (pH 7,4) gewaschen. Eine 5%ige Blockierungslösung aus Rinderserumalbumin (BSA) wurde bei Raumtemperatur 20 Minuten lang zugegeben und die überschüssige Flüssigkeit wurde verworfen. Polyklonale Kaninchen-Anti-Mensch-VEGF-C-Antikörper (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: 1:100 verdünnt) wurden der Inkubation bei 37°C für 24 h zugesetzt, und die Schnitte wurden dann gewaschen 5 Minuten. dreimal. Eine biotinylierte Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Arbeitslösung (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) wird in einer Verdünnung von 1:1000 für eine 20-minütige Inkubation bei 37 °C hinzugefügt. Nach dem Waschen wird SABC zur Inkubation bei 37°C für 20 min hinzugefügt, gefolgt von Waschen und Farbentwicklung über Diaminobenzidin (DAB) (DAB-Farbentwicklungskit, Dako, Dinamarca) bei Raumtemperatur für 5 bis 30 min durch Waschen mit destilliertem Wasser, erneute Hämatoxylin-Färbung, Dehydratisierung über abgestuftes Ethanol, Transparenz über Xylol, Versiegelung über Neutralgummi und Untersuchung unter dem Lichtmikroskop. Der primäre Antikörper wurde durch PBS als Negativkontrolle ersetzt. Die positiven Schnitte, die im Vorexperiment zufriedenstellend gefärbt waren, wurden als positive Kontrollen verwendet.

Morphologische und histomorphometrische Analysen Zur Quantifizierung der interessierenden Parameter wurden Bilder mit einer hochauflösenden Kamera (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) aufgenommen, die an ein Lichtmikroskop (Axiolab, Carl Zeiss) angepasst und mit 40×-Objektiven eingestellt wurde. Die Bilder wurden auf einen Computer mit der Software AxioVision Rel 4.2 (Carl Zeiss) übertragen. Zur Beurteilung der Drüsen- und Oberflächenepitheldicke, der Zellzahl und des Zählens neu gebildeter Blutgefäße wurden für jede Patientin zehn Bilder jeder Endometriumprobe gemacht. Für die VEGF-C-Bestimmung wird die numerische Dichte der Blutgefäße pro mm2 ermittelt.

Statistische Analysen Die für jede Gruppe erforderliche Mindeststichprobengröße wird aus einer Pilotstudie mit 10 Frauen pro Gruppe nach der Pilotstudie bestimmt. Daher wird bei der Berechnung des Stichprobenumfangs die Korrelation zwischen den Gruppenmessungen berücksichtigt. Für die Ergebnisse der Anzahl der Endometriumdrüsen wurde ein Typ-I-Fehler von 5 % und ein Typ-II-Fehler von 20 % (Stichprobe mit 0,8 % Power) für den Nachweis von > 20 % Unterschied zwischen den Gruppen angenommen. Entsprechend der Homogenität werden die quantitativen Daten als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. In Übereinstimmung mit der Datenverteilung wird der Student-t-Test oder der Mann-Whitney-U-Test verwendet. Das Signifikanzniveau wurde auf 95 % (α ≤ 5 %) festgelegt. Darüber hinaus werden ANOVA oder der Kruskal-Wallis-Test für histologische und immunhistochemische Vergleiche verwendet, wenn die zusätzliche Gruppe (PCOS während der proliferativen Phase) eingeschlossen wurde. Dann wird entsprechend der Datenverteilung entweder der Tukey-Test oder der Dunn-Test angewendet. Wenn möglich, wurden die Themen von Studie A und B für die Analyse kombiniert.