Progesteronvirkning på endometrium af PCOS

PATIENTER OG METODER

Emner Inklusionskriterier for PCOS-kvinder vil være: a) i alderen 18 til 35 år, og b) PCOS blev defineret af Rotterdam-kriterierne, som omfatter to af følgende tre træk: a) oligo-amenoré; b) kliniske eller biokemiske tegn på hyperandrogenisme; og c) polycystiske ovarier (6). Disse kriterier giver fire PCOS-fænotyper (A til D) (1-3). Kontroller blev rekrutteret fra ambulatoriet for familieplanlægning. Alle deltagere vil være raske kvinder i alderen 18 til 35 år med regelmæssige menstruationscyklusser, ingen tegn på hirsutisme, ingen følgesygdomme og ikke bruge hormonmedicin i de foregående 3 måneder.

Udelukkelseskriterier er som følger: a) brug af enhver hormonbehandling inden for de foregående 3 måneder; b) andre årsager til anovulering som påvist ved unormale niveauer af prolaktin, cortisol, dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), 17-hydroxyprogesteron (17-OHP), androstenedion, thyreoidea-stimulerende hormon (TSH) og fri T4 i blodprøver opnået mellem kl. dag 2 og 5 i cyklussen hos cyklende forsøgspersoner eller på en hvilken som helst anden dag hos amenoréiske forsøgspersoner; c) gynækologiske lidelser eller andre associerede sygdomme, såsom endometriose, hypertension eller diabetes mellitus; d) follikelstimulerende hormon (FSH) >15 UI/L (cyklusdage 2-5); eller e) en positiv β-underenhed af humant choriongonadotropin (β-HCG).

Studieprotokol

Dette forsøg blev tidligere godkendt af den forskningsetiske komité (#21253613.6.0000.0068) ved Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brasilien. Patienterne vil blive evalueret på Gynækologisk Ambulatorium. Patienterne vil blive opdelt i to grupper: a) PCOS og b) kontroller. Alle emner vil blive behandlet på endokrinologisk gynækologisk sektion og Human Reproductive Center i Gynecology Division, Hospital das Clínicas, FMUSP. Efter underskrivelse af det informerede samtykke vil blive skrevet i overensstemmelse med resolution 196/96 fra National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), alle emner vil blive inkluderet i undersøgelsen og evalueret som følger:

Forudvalg: Dette besøg omfatter følgende: interview for medicinsk historie; generelle fysiske og gynækologiske undersøgelser; vægtmåling (skala Filizola, model PL-150, med en kapacitet til 150 kg); højdemåling med et metalstadiometer fastgjort til skalaen; abdominal omkreds (AC) måling med et målebånd i det smalleste område mellem den sidste kystbue og hoftekammen; hofteomkreds (HC) målt omkring hofternes omkreds i toppen af ​​hoftekammen og balderne, body mass index (BMI) og blodtryk (BP) måling; hirsutisme ifølge det modificerede Ferriman-Gallwey (mFG)-scoringssystem med ni områder, hvor patienter med en score højere end 8-score anses for hirsutte.

Menstruationscyklussen betragtes som normal, når intervallet mellem menstruationerne var 21 til 35 dage, og blodgennemstrømningen varede ikke mere end 7 dage. Cyklusen blev karakteriseret som anovulatorisk, når spændet mellem blodstrømme var >35 dage (1). Amenoré er defineret som fravær af menstruationsflow i en periode svarende til de tre foregående cyklusser eller i >90 dage (1,20).

Blod vil blive indsamlet og en transvaginal bækken-ultralyd vil blive udført på alle forsøgspersoner.

Studie A: Seks PCOS-patienter med amenoré (cyklusser >90 dage) og negativ β-HCG vil blive ordineret dagligt mikroniseret P4 (400 mg) administreret via vaginal vej i 10 dage. To endometriebiopsier vil blive udført, en mellem den 5. og 9. dag og den anden mellem den 21. og 24. dag (under den anden behandlingscyklus med P4) i menstruationscyklussen (dag 1 er den første dag med vaginal blødning). En tredje biopsi vil blive gentaget på den 4. cyklus af P4-behandling, mellem cyklusdage 21 og 24 (fig. 2). Denne del af undersøgelsen vil blive designet til at vurdere, om P4 kunne transformere proliferativ til sekretorisk endometrium, uanset antallet af behandlingscyklusser.

Undersøgelse B:

PCOS: Sytten PCOS-personer gennemgik to endometriebiopsier efter den første P4-behandlede cyklus, den første mellem dag 5-9 i cyklussen og den anden mellem dag 20-22 (dvs. under P4-behandling) af cyklussen.

Kontroller: Tretten ægløsningskontrolkvinder under to endometriebiopsier vil blive udført efter den første måned af luteal P4-behandling, den første mellem dag 5-9 og den anden mellem dag 20-22 i cyklussen.

Assays Den orale glucosetolerancetest (OGTT) bestod af 75 gram glucose indgivet oralt efter tre dage med en kulhydratrig diæt; blodprøver til glukose- og insulinmålinger blev udtaget før administration af glukoseopløsningen og 30, 60, 90 og 120 minutter efter indtagelse af glucoseopløsningen.

Plasmaglucosekoncentration blev bestemt ved glucoseoxidasemetoden. Alle lipidmålinger blev taget direkte i plasmaprøverne. Totalt kolesterol og triglycerider blev vurderet ved anvendelse af enzymmetoder (Roche Laboratories). HDL-C blev kvantificeret ved den samme metode, og LDL-C blev estimeret med Friedwald-formlen. Det glykohæmoglobin blev målt ved hjælp af højtydende væskekromatografi (ved brug af Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohæmoglobin Analyzer-metoden i 2003-2004 og Tosoh G7-metoden i 2007-2008, Tosoh Corp).

Til hormonanalyser blev blodprøverne behandlet i en centrifuge. Progesteron blev målt ved det immunfluorometriske assay (Wallac, Finland) under anvendelse af Auto DELFIA-kits; androstenedion, PRL, LH og FSH, ved det immunfluorometriske assay; dehydroepiandrosteronsulfat (DHEAS), ved radioimmunoassay (Cisbio International, Frankrig og DSL, Texas, USA); og insulin og 17-OHP ved radioimmunoassay under anvendelse af DSL-kits. Testosteron- og SHBG-niveauerne blev målt under anvendelse af det elektrokemiluminescerende immunoassay (Modular, Roche). Det frie testosteronindeks blev beregnet ud fra følgende formel: total testosteron/SHBG*100. Frit testosteron blev beregnet ved Vermeulens formel. Alle analyser blev udført to gange, og variationskoefficienterne for intra-assay og interassay oversteg ikke henholdsvis 10 % og 15 %.

Endometriebiopsier Endometrieprøver vil blive udtaget ved hjælp af Pipelle de Cornier kateteret (Laboratoire CCD, Paris, Frankrig). En del af materialet blev indlejret i paraffin til histomorfometriske og immunhistokemiske analyser, og resten blev konserveret i RNA til senere molekylære analyser.

Histokemi Endometrieprøver vil blive fikseret i 24 timer. i 10 % formaldehyd, dehydreret i stigende koncentrationer af ethylalkohol, klaret i xylen og derefter indlejret i paraffin. De paraffinindlejrede prøver vil derefter blive skåret i ti 3-μm sektioner pr. emne. Otte af disse sektioner blev farvet for vaskulær endothelial vækstfaktor C (VEGF-C) og til immunhistokemi (se nedenfor), og de to resterende sektioner vil blive farvet med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at bekræfte menstruationscyklusfasen ved at bruge de foreslåede kriterier af Noyes et al. (1953) og morfometri (se nedenfor).

Sektioner vil blive afvokset konventionelt; 0,3 % H2O2 vil blive brugt til at inaktivere endogen peroxidase ved stuetemperatur i 10 minutter, efterfulgt af vask med destilleret vand tre gange. Sektionerne blev nedsænket i 0,01 M citratbuffer (pH 6,0) og derefter anbragt i en mikrobølgeovn til opvarmning til kogepunktet. Efter 10 min vil denne proces blive gentaget to gange; derefter blev sektionerne afkølet ved stuetemperatur og vasket to gange med phosphatpufret saltvand (PBS) (pH 7,4). En 5% bovint serumalbumin (BSA) blokerende opløsning blev tilsat ved stuetemperatur i 20 minutter, og den overskydende væske blev kasseret. Kanin anti-humane VEGF-C polyklonale antistoffer (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: fortyndet ved 1:100) blev tilsat til inkubationen ved 37°C i 24 timer, og sektionerne blev derefter vasket i 5 min. tre gange. En biotinyleret gede-anti-kanin IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) arbejdsopløsning tilsættes ved 1:1000 fortynding til inkubation ved 37°C i 20 min. Efter vask tilsættes SABC til inkubationen ved 37°C i 20 minutter, efterfulgt af vask og farveudvikling via diaminobenzidin (DAB) (DAB farveudviklingskit, Dako, Dinamarca) ved stuetemperatur i 5 til 30 minutter, efterfulgt af ved vask med destilleret vand, hæmatoxylin genfarvning dehydrering via graderet ethanol, gennemsigtighed via xylen, forsegling via neutral gummi og inspektion under lysmikroskop. Det primære antistof blev erstattet med PBS som en negativ kontrol. De positive snit, der farvede tilfredsstillende i præ-eksperimentet, blev brugt som positive kontroller.

Morfologiske og histomorfometriske analyser For at kvantificere parametrene af interesse blev billeder taget ved hjælp af et højopløsningskamera (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) tilpasset til et lysmikroskop (Axiolab, Carl Zeiss) og justeret med 40× objektivlinser. Billederne blev overført til en computer med AxioVision Rel 4.2 software (Carl Zeiss). Til vurdering af kirtel- og overfladeepiteltykkelse, celletal og optælling af nydannede blodkar blev der lavet ti billeder af hver endometrieprøve for hver patient. Til VEGF-C-bestemmelse vil den numeriske tæthed af blodkar pr. mm2 blive fastsat.

Statistiske analyser Den mindste prøvestørrelse, der er nødvendig for hver gruppe, vil blive bestemt ud fra en pilotundersøgelse med 10 kvinder pr. gruppe efter pilotundersøgelse. Ved beregning af stikprøvestørrelsen vil korrelationen mellem gruppemålingerne således blive taget i betragtning. For resultaterne af antallet af endometriekirtler blev en type I-fejl på 5 % og en type II-fejl på 20 % (prøve med 0,8 % effekt) anvendt til påvisning af >20 % forskel mellem grupperne. I overensstemmelse med homogenitet vil de kvantitative data blive udtrykt som middel ± standardafvigelse. I overensstemmelse med datadistribution vil Student t-testen eller Mann-Whitney U-testen blive brugt. Signifikansniveauet blev sat til 95 % (α ≤ 5 %). Desuden vil ANOVA eller Kruskal-Wallis testen blive brugt til histologiske og immunhistokemiske sammenligninger, når den yderligere gruppe (PCOS under den proliferative fase) blev inkluderet. I overensstemmelse med datafordelingen vil enten Tukey-testen eller Dunn-testen blive anvendt. Når det var muligt, blev emnerne fra undersøgelse A og B kombineret til analyse.