Progesteron Actie op endometrium van PCOS

PATIENTEN EN METHODES

Onderwerpen Inclusiecriteria voor PCOS-vrouwen zijn: a) leeftijden van 18 tot 35 jaar, en b) PCOS werd gedefinieerd door de criteria van Rotterdam, die twee van de volgende drie kenmerken omvat: a) oligo-amenorroe; b) klinische of biochemische tekenen van hyperandrogenisme; en c) polycysteuze eierstokken (6). Deze criteria leveren vier PCOS-fenotypes op (A tot en met D) (1-3). Controles werden gerekruteerd uit het polikliniekbureau voor gezinsplanning. Alle deelnemers zijn gezonde vrouwen van 18 tot 35 jaar met regelmatige menstruatiecycli, geen bewijs van hirsutisme, geen comorbiditeiten en die de afgelopen 3 maanden geen hormoonmedicatie hebben gebruikt.

Uitsluitingscriteria zijn als volgt: a) gebruik van een hormoonbehandeling in de voorgaande 3 maanden; b) andere oorzaken van anovulatie zoals blijkt uit abnormale niveaus van prolactine, cortisol, dehydroepiandrosteronsulfaat (DHEAS), 17-hydroxyprogesteron (17-OHP), androsteendion, schildklierstimulerend hormoon (TSH) en vrij T4, in bloedmonsters verkregen tussen dag 2 en 5 van de cyclus bij fietsende proefpersonen of op een andere dag bij amenorroïsche proefpersonen; c) gynaecologische aandoeningen of andere geassocieerde ziekten, zoals endometriose, hypertensie of diabetes mellitus; d) follikelstimulerend hormoon (FSH) >15 UI/L (cyclusdagen 2-5); of e) een positieve β-subeenheid van humaan choriongonadotrofine (β-HCG).

Leerprotocool

Deze proef werd eerder goedgekeurd door de Research Ethics Committee (#21253613.6.0000.0068) van de Faculdade de Medicina, Hospital das Clínicas, Universidade de São Paulo (FMUSP), São Paulo, Brazilië. De patiënten worden beoordeeld op het kantoor van de polikliniek Gynaecologie. De patiënten worden verdeeld in twee groepen: a) PCOS en b) controles. Alle proefpersonen zullen worden verzorgd in de afdeling Endocrinologie Gynaecologie en het Human Reproductive Center van de afdeling Gynaecologie, Hospital das Clínicas, FMUSP. Na ondertekening van de geïnformeerde toestemming zal worden geschreven in overeenstemming met resolutie 196/96 van de National Health Board (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde), zullen alle proefpersonen in het onderzoek worden opgenomen en als volgt worden geëvalueerd:

Voorselectie: Dit bezoek omvat het volgende: interview voor medische geschiedenis; algemeen lichamelijk en gynaecologisch onderzoek; gewichtsmeting (weegschaal Filizola, model PL-150, met een capaciteit van 150 kg); hoogtemeting met een metalen stadiometer bevestigd aan de schaal; meting van de buikomtrek (AC) met een meetlint op het smalste gebied tussen de laatste ribbenboog en de crista iliaca; heupomtrek (HC) gemeten rond de omtrek van de heupen aan de bovenkant van de bekkenkam en billen, body mass index (BMI) en bloeddruk (BP) meting; hirsutisme volgens het gemodificeerde Ferriman-Gallwey (mFG) scoresysteem met negen gebieden, waarbij patiënten met een score hoger dan 8 als behaard worden beschouwd.

De menstruatiecyclus wordt als normaal beschouwd wanneer het interval tussen de menstruaties 21 tot 35 dagen was en de bloedstroom niet langer dan 7 dagen duurde. De cyclus werd gekarakteriseerd als anovulatoir wanneer de periode tussen bloedstromen >35 dagen was (1). Amenorroe wordt gedefinieerd als de afwezigheid van een menstruatie gedurende een periode die overeenkomt met de drie voorgaande cycli of gedurende >90 dagen (1,20).

Bij alle proefpersonen zal bloed worden afgenomen en een transvaginale echografie van het bekken worden uitgevoerd.

Studie A: Zes PCOS-patiënten met amenorroe (cycli >90 dagen) en negatieve β-HCG krijgen dagelijks gemicroniseerd P4 (400 mg) voorgeschreven via de vaginale route gedurende 10 dagen. Er zullen twee endometriumbiopten worden uitgevoerd, één tussen de 5e en 9e dag en de andere tussen de 21e en 24e dag (onder de tweede behandelingscyclus met P4) van de menstruatiecyclus (dag 1 is de eerste dag van vaginale bloeding). Een derde biopsie zal worden herhaald tijdens de 4e cyclus van de P4-behandeling, tussen cyclusdag 21 en 24 (fig. 2). Dit deel van de studie zal worden opgezet om te beoordelen of P4 proliferatief endometrium kan omzetten in secretoir endometrium, ongeacht het aantal behandelingscycli.

Studie B:

PCOS: Zeventien PCOS-proefpersonen ondergingen twee endometriumbiopten na de eerste met P4 behandelde cyclus, de eerste tussen dag 5-9 van de cyclus en de andere tussen dag 20-22 (d.w.z. onder P4-behandeling) van de cyclus.

Controles: Dertien ovulatoire controlevrouwen onder twee endometriumbiopten zullen worden uitgevoerd na de eerste maand van luteale P4-behandeling, de eerste tussen dag 5-9 en de tweede tussen dag 20-22 van de cyclus.

Assays De orale glucosetolerantietest (OGTT) bestond uit 75 gram glucose oraal toegediend na drie dagen van een koolhydraatrijk dieet; bloedmonsters voor glucose- en insulinemetingen werden genomen vóór toediening van de glucoseoplossing en 30, 60, 90 en 120 minuten na inname van de glucoseoplossing.

De glucoseconcentratie in het plasma werd bepaald met behulp van de glucose-oxidasemethode. Alle lipidenmetingen werden rechtstreeks in de plasmamonsters uitgevoerd. Totaal cholesterol en triglyceriden werden beoordeeld met behulp van enzymmethoden (Roche Laboratories). Het HDL-C werd met dezelfde methode gekwantificeerd en het LDL-C werd geschat met de Friedwald-formule. Het geglyceerde hemoglobine werd gemeten met behulp van krachtige vloeistofchromatografie (met gebruik van de Tosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobine Analyzer-methode in 2003-2004 en de Tosoh G7-methode in 2007-2008, Tosoh Corp).

Voor hormoonanalyses werden de bloedmonsters verwerkt in een centrifuge. Progesteron werd gemeten met de immunofluorometrische assay (Wallac, Finland) met behulp van Auto DELFIA-kits; androsteendion, PRL, LH en FSH, door de immunofluorometrische assay; dehydroepiandrosteronsulfaat (DHEAS), door radioimmunoassay (Cisbio International, Frankrijk en DSL, Texas, VS); en insuline en 17-OHP, door radioimmunoassay met behulp van DSL-kits. De testosteron- en SHBG-niveaus werden gemeten met behulp van de elektrochemiluminescente immunoassay (Modular, Roche). De vrije testosteron-index werd berekend op basis van de volgende formule: totaal testosteron/SHBG*100. Vrij testosteron werd berekend met de formule van Vermeulen. Alle analyses werden tweemaal uitgevoerd en de variatiecoëfficiënten binnen de assay en tussen de assays waren niet hoger dan respectievelijk 10% en 15%.

Endometriumbiopten Endometriummonsters zullen worden verkregen met behulp van de Pipelle de Cornier-katheter (Laboratoire CCD, Parijs, Frankrijk). Een deel van het materiaal werd ingebed in paraffine voor histomorfometrische en immunohistochemische analyses, en de rest werd bewaard in RNA voor latere moleculaire analyses.

Histochemie Endometriummonsters worden 24 uur gefixeerd. in 10% formaldehyde, gedehydrateerd in toenemende concentraties ethylalcohol, geklaard in xyleen en vervolgens ingebed in paraffine. De in paraffine ingebedde monsters worden vervolgens in tien secties van 3 μm per proefpersoon gesneden. Acht van deze secties werden gekleurd voor vasculaire endotheliale groeifactor C (VEGF-C) en voor immunohistochemie (zie hieronder), en de twee resterende secties zullen worden gekleurd met hematoxyline en eosine (H&E) om de fase van de menstruatiecyclus te bevestigen met behulp van de voorgestelde criteria door Noyes et al. (1953) en morfometrie (zie hieronder).

Secties worden conventioneel van was ontdaan; 0,3% H2O2 wordt gebruikt om endogene peroxidase gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te inactiveren, gevolgd door driemaal wassen met gedestilleerd water. De secties werden ondergedompeld in 0,01 M citraatbuffer (pH 6,0) en vervolgens in een magnetron geplaatst om tot het kookpunt te verwarmen. Na 10 min wordt dit proces twee keer herhaald; vervolgens werden de secties afgekoeld tot kamertemperatuur en tweemaal gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (pH 7,4). Een 5% runderserumalbumine (BSA) blokkerende oplossing werd toegevoegd bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten en de overmaat vloeistof werd weggegooid. Polyklonale antilichamen tegen humaan VEGF-C van konijnen (Cell Signaling, Danvers, MA, VS) (VEGF-C: verdund tot 1:100) werden toegevoegd aan de incubatie bij 37°C gedurende 24 uur, en de coupes werden vervolgens gedurende 24 uur gewassen. 5 minuten. driemaal. Een gebiotinyleerde geiten-anti-konijnen-IgG (Cell Signaling, Danvers, MA, VS) werkoplossing zal worden toegevoegd in een verdunning van 1:1000 voor incubatie bij 37°C gedurende 20 minuten. Na het wassen wordt SABC toegevoegd aan de incubatie bij 37°C gedurende 20 min, gevolgd door wassen en kleurontwikkeling via diaminobenzidine (DAB) (DAB kleurontwikkelingskit, Dako, Dinamarca) bij kamertemperatuur gedurende 5 tot 30 min., gevolgd door door wassen met gedestilleerd water, hematoxyline opnieuw vlekken uitdroging via gegradeerde ethanol, transparantie via xyleen, verzegeling via neutrale gom en inspectie onder een lichtmicroscoop. Het primaire antilichaam werd vervangen door PBS als negatieve controle. De positieve secties die bevredigend kleurden in het pre-experiment werden gebruikt als positieve controles.

Morfologische en histomorfometrische analyses Om de van belang zijnde parameters te kwantificeren, werden beelden vastgelegd met behulp van een camera met hoge resolutie (AxioCam-MCR, Carl Zeiss) aangepast aan een lichtmicroscoop (Axiolab, Carl Zeiss) en aangepast met 40 × objectieflenzen. De beelden werden verzonden naar een computer met AxioVision Rel 4.2-software (Carl Zeiss). Voor beoordeling van de dikte van het klier- en oppervlakte-epitheel, het aantal cellen en het tellen van nieuw gevormde bloedvaten, werden voor elke patiënt tien beelden van elk endometriummonster gemaakt. Voor VEGF-C bepaling wordt de numerieke dichtheid van bloedvaten per mm2 bepaald.

Statistische analyses De minimale steekproefomvang die nodig is voor elke groep zal worden bepaald op basis van een pilotstudie met 10 vrouwen per groep na pilotstudie. Bij het berekenen van de steekproefomvang zal dus rekening worden gehouden met de correlatie tussen de groepsmetingen. Voor de resultaten van het aantal endometriumklieren werd een type I-fout van 5% en een type II-fout van 20% (steekproef met 0,8% power) aangenomen voor de detectie van >20% verschil tussen groepen. In overeenstemming met de homogeniteit zullen de kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Conform de datadistributie wordt de Student t-toets of de Mann-Whitney U-toets gebruikt. Het significantieniveau werd vastgesteld op 95% (α ≤ 5%). Bovendien zal ANOVA of de Kruskal-Wallis-test worden gebruikt voor histologische en immunohistochemische vergelijkingen, wanneer de aanvullende groep (PCOS tijdens de proliferatieve fase) werd opgenomen. Vervolgens wordt, in overeenstemming met de gegevensdistributie, de Tukey-test of de Dunn-test toegepast. Waar mogelijk werden de proefpersonen van onderzoek A en B gecombineerd voor analyse.