PCOSの子宮内膜に対するプロゲステロン作用

患者と方法

PCOS女性の被験者対象基準は、a) 18歳から35歳、およびb) PCOSはロッテルダム基準によって定義され、次の3つの特徴のうち2つが含まれます。 b) 高アンドロゲン症の臨床的または生化学的徴候; c) 多嚢胞性卵巣 (6)。 これらの基準により、4 つの PCOS 表現型 (A から D) が得られます (1-3)。 コントロールは、家族計画外来から募集されました。 すべての参加者は、月経周期が規則的で、多毛症の証拠がなく、併存疾患がなく、過去 3 か月間ホルモン薬を使用していない 18 歳から 35 歳の健康な女性です。

除外基準は次のとおりです。 a) 過去 3 か月間のホルモン治療の使用。 b) プロラクチン、コルチゾール、硫酸デヒドロエピアンドロステロン (DHEAS)、17-ヒドロキシプロゲステロン (17-OHP)、アンドロステンジオン、甲状腺刺激ホルモン (TSH)、および遊離 T4 の異常なレベルによって証明される無排卵の他の原因。サイクリング被験者のサイクルの2日目と5日目、または無月経被験者の他の日; c) 子宮内膜症、高血圧、糖尿病などの婦人科疾患またはその他の関連疾患; d) 卵胞刺激ホルモン (FSH) >15 UI/L (周期 2～5 日目);または e) ヒト絨毛性ゴナドトロピン (β-HCG) の正の β サブユニット。

研究プロトコル

この試験は、ブラジル、サンパウロ、サンパウロ大学 (FMUSP)、病院ダス クリニカス、医学部の研究倫理委員会 (#21253613.6.0000.0068) によって以前に承認されました。 患者は婦人科外来で評価されます。 患者は 2 つのグループに分けられます: a) PCOS および b) コントロール。 すべての被験者は、内分泌学婦人科部門および婦人科部門の人間生殖センター、Hospital das Clínicas、FMUSP で治療を受けます。 インフォームド コンセントに署名した後、国民保健委員会の決議 196/96 (Resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde) に従って、すべての被験者が研究に含まれ、次のように評価されます。

事前選択: この訪問には以下が含まれます: 病歴に関するインタビュー。全体的な身体検査および婦人科検査;重量測定 (Filizola、モデル PL-150、容量 150 kg);スケールに取り付けられた金属製スタディオメーターによる身長測定。最後の肋骨弓と腸骨稜の間の最も狭い領域で巻尺を使用して腹囲 (AC) を測定します。腸骨稜と臀部の上部で腰の周囲を測定した腰囲（HC）、体格指数（BMI）および血圧（BP）測定。多毛症は、修正された Ferriman-Gallwey (mFG) スコアリング システムによる 9 つの領域の多毛症であり、スコアが 8 を超える患者は多毛と見なされます。

月経周期は、月経間隔が 21 ～ 35 日で、血流が 7 日以内であれば正常と見なされます。 このサイクルは、血流間のスパンが 35 日を超える場合に無排卵として特徴付けられました (1)。 無月経は、前の 3 周期に対応する期間、または 90 日以上月経がないことと定義されます (1,20)。

血液を採取し、すべての被験者に対して経膣骨盤超音波検査を実施します。

研究 A: 無月経 (サイクル > 90 日) および陰性の β-HCG を有する 6 人の PCOS 患者は、10 日間膣経路を介して投与される微粉化 P4 (400 mg) を毎日処方されます。 2回の子宮内膜生検が行われ、1回は月経周期の5日目と9日目の間、もう1回目は月経周期の21日目と24日目（P4による2回目の治療サイクルの下）の間に行われます（1日目は膣出血の最初の日です）。 3 回目の生検は、P4 治療の 4 回目のサイクルで、サイクル 21 日目と 24 日目の間に繰り返されます (図 2)。 研究のこの部分は、治療サイクルの数に関係なく、P4が増殖性子宮内膜を分泌性子宮内膜に変換できるかどうかを評価するように設計されます。

スタディ B:

PCOS: 17 人の PCOS 被験者が、最初の P4 治療サイクルの後に 2 つの子宮内膜生検を受けました。

コントロール: 2 つの子宮内膜生検下の 13 人の排卵コントロール女性は、黄体 P4 治療の最初の 1 か月後に実行されます。

アッセイ 経口ブドウ糖負荷試験 (OGTT) は、3 日間の高炭水化物食後に経口投与された 75 グラムのブドウ糖で構成されていました。グルコースおよびインスリン測定のための血液サンプルは、グルコース溶液の投与前と、グルコース溶液摂取の 30、60、90、および 120 分後に採取されました。

血漿グルコース濃度は、グルコースオキシダーゼ法により測定した。 すべての脂質測定は、血漿サンプルで直接行われました。 総コレステロールとトリグリセリドは、酵素法 (Roche Laboratories) を使用して評価されました。 HDL-C は同じ方法で定量化され、LDL-C はフリードワルド式で推定されました。 糖化ヘモグロビンは、高速液体クロマトグラフィーを使用して測定されました（2003-2004年にはTosoh A1c 2.2 Plus Glycohemoglobin Analyzerメソッド、2007-2008年にはTosoh G7メソッドを使用、東ソー株式会社）。

ホルモン分析のために、血液サンプルを遠心分離機で処理しました。 プロゲステロンは、Auto DELFIA キットを使用した免疫蛍光アッセイ (Wallac、フィンランド) によって測定されました。免疫蛍光アッセイによるアンドロステンジオン、PRL、LH、および FSH。ラジオイムノアッセイによるデヒドロエピアンドロステロン硫酸塩（DHEAS）（Cisbio International、フランスおよびDSL、テキサス、米国）; DSLキットを使用したラジオイムノアッセイによるインスリンと17-OHP。 テストステロンおよびSHBGレベルは、電気化学発光イムノアッセイ(Modular、Roche)を使用して測定した。 遊離テストステロン指数は、総テストステロン/SHBG*100という式に基づいて計算されました。 遊離テストステロンは、Vermeulen の式によって計算されました。 すべての分析は 2 回実行され、アッセイ内およびアッセイ間の変動係数は、それぞれ 10% および 15% を超えませんでした。

子宮内膜生検 子宮内膜サンプルは、Pipelle de Cornier カテーテル (Laboratoire CCD、パリ、フランス) を使用して取得されます。 材料の一部は、組織形態計測および免疫組織化学分析のためにパラフィンに埋め込まれ、残りは後の分子分析のためにRNAに保存されました。

組織化学 子宮内膜サンプルは 24 時間固定されます。 10% ホルムアルデヒドで溶解し、エチル アルコールの濃度を上げて脱水し、キシレンで透明にし、パラフィンに包埋します。 パラフィン包埋サンプルは、被験者ごとに 10 個の 3 μm セクションに切断されます。 これらのセクションのうち 8 つは、血管内皮増殖因子 C (VEGF-C) および免疫組織化学 (下記参照) のために染色され、残りの 2 つのセクションは、提案された基準を使用して月経周期を確認するためにヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) で染色されます。 Noyesらによる。 （1953）および形態計測（下記参照）。

切片は通常の方法でワックスを除去します。 0.3% H2O2 を使用して内因性ペルオキシダーゼを室温で 10 分間不活性化し、続いて蒸留水で 3 回洗浄します。 切片を０．０１Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）に浸した後、電子レンジに入れて沸点まで加熱した。 10 分後、このプロセスが 2 回繰り返されます。次に、切片を室温で冷却し、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）（pH 7.4）で2回洗浄しました。 ５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ブロッキング溶液を室温で２０分間添加し、過剰の液体を廃棄した。 ウサギ抗ヒト VEGF-C ポリクローナル抗体 (Cell Signaling, Danvers, MA, USA) (VEGF-C: 1:100 希釈) を 37°C で 24 時間のインキュベーションに加え、切片を洗浄しました。 5分。 3回。 ビオチン化ヤギ抗ウサギ IgG (Cell Signaling、ダンバーズ、マサチューセッツ州、米国) 作業溶液を 1:1000 希釈で加え、37°C​​ で 20 分間インキュベートします。 洗浄後、ＳＡＢＣを３７℃で２０分間インキュベーションに添加し、続いて洗浄し、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）（ＤＡＢ発色キット、Ｄａｋｏ、Ｄｉｎａｍａｒｃａ）を介して室温で５〜３０分間発色させ、その後、蒸留水による洗浄、段階的エタノールによるヘマトキシリン再染色脱水、キシレンによる透明化、中性ガムによるシール、および光学顕微鏡による検査によって。 一次抗体は、陰性対照として PBS に置き換えられました。 前実験で十分に染色された陽性切片を陽性対照として使用した。

形態学的および組織形態学的分析 関心のあるパラメータを定量化するために、光学顕微鏡（Axiolab、Carl Zeiss）に適合させ、40倍の対物レンズで調整した高解像度カメラ（AxioCam-MCR、Carl Zeiss）を使用して画像をキャプチャしました。 画像は、AxioVision Rel 4.2 ソフトウェア (Carl Zeiss) を使用してコンピューターに送信されました。 腺および表面上皮の厚さ、細胞数、および新しく形成された血管の数を評価するために、各患者について各子宮内膜サンプルの10枚の画像が作成されました。 VEGF-C の測定では、mm2 あたりの血管の数値密度が確立されます。

統計分析 各グループに必要な最小サンプル サイズは、パイロット スタディ後にグループあたり 10 人の女性を対象としたパイロット スタディから決定されます。 したがって、サンプルサイズの計算では、グループ測定値間の相関が考慮されます。 子宮内膜腺の数の結果については、タイプ I 誤差 5% およびタイプ II 誤差 20% (検出力 0.8% のサンプル) を採用して、グループ間で 20% を超える差を検出しました。 均一性に応じて、定量データは平均 ± 標準偏差として表されます。 データの分布に合わせて、スチューデントの t 検定またはマンホイットニーの U 検定を使用します。 有意水準は 95% (α ≤ 5%) に設定されました。 さらに、ANOVA または Kruskal-Wallis テストは、追加のグループ (増殖期の PCOS) が含まれている場合、組織学的および免疫組織化学的比較に使用されます。 次に、データ分布に合わせて、Tukey 検定または Dunn 検定のいずれかが適用されます。 可能であれば、研究 A と研究 B の被験者を組み合わせて分析しました。